基因工程实验.pptxVIP

实验一：碱裂解法抽提 质粒DNA;一、实验目的;二、实验原理; 当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。 通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿处理，可除残留蛋白质 ;三、材料、试剂及仪器;3 仪器及设备 高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩??振荡器 培养用试管、量筒、冰盒、微量离心管、微量取液器、吸管头若干 ;四、实验步骤;2 质粒DNA的提取 取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 ? 5000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体（如果想提取多一点DNA，再吸取1.5ml菌液到同一离心管中，离心，弃上清）:离心时离心管方向要固定，柄朝外，方便看是否离下来 ? 用移液枪尽可能除去上清液，然后150uL溶液I悬浮菌体 用涡旋振荡器充分振荡 ：溶液I最好要放冰上 ? 加入250uL溶液II，缓慢上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰上静置5min ：充分裂解菌体 ; ? 加入180uL预冷的溶液III，上下翻转十多下，温和混匀，冰上静置10min或者放入-20℃冰箱5min : 使染色体DNA等沉淀，而质粒DNA复性 ? 12000rpm，4℃离心5min。 ? 取上清。加2/3体积的酚/氯仿12000rpm，混匀。12000rmp离心5min ：用于抽提脂类，蛋白质等。 在混匀时，要盖紧盖子，用纸巾包住离心管，来回翻转。离心后会发现溶液分三层，上层为含DNA，RNA的水相，中间为蛋白质，下层为有机相 ? 移取上清液，加2倍体积的无水乙醇（大量提取时可以用0.6倍的异丙醇代替），混匀：用于沉淀DNA，; ? 12000rpm离心5min，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液枪尽可能除去酒精。用0.5ml 70%酒精洗DNA一次，离心2min，倒掉酒精 70%酒精可以使DNA保持不溶解的状态，30%的水还可以使离子洗去 ? 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干十分钟 此时DNA变成无色透明 ? 加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置金属浴65℃加热10min或37℃放置数小时 使RNaseA发挥作用，并且DNA酶在此条件下会失活 ? -20℃保存备用 ;3 质粒DNA的进一步纯化 加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充分振荡：会分三层 ? 12000rpm，离心5分钟，吸取上清液 ? 加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清 ? 加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀。 ? 置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个小时;? 12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精 ? 用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精 ? 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。 ? 加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase） ;五、实验注意事项;3 细菌培养后可通过肉眼观察分辨是否有杂菌：大肠杆菌的应为乳白色或淡黄色，有杂菌的会发红 4 氯仿有毒性，见光会产生有毒光气，所以要保存于棕色瓶里，任何涉及氯仿的操作都要在通风厨内使用。并且氯仿会溶解塑料，吸取时把离心管靠近些 RNaseA可加入TE中，也可加入SolutionⅠ中 加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动 ;六、思考题;2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要