研究生分生带教课件 .pptx

; 单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells--PBMC） 是血液中含未分叶核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞;; 抑制RNA酶活性的试剂 焦磷酸二乙酯（DEPC)：一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶 异硫氰酸胍：一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性 ; 1、外周血单个核细胞的分离 1）吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管，待用 2）取抗凝血1ml，用1ml生理盐水混匀，然后沿管壁缓慢加入淋巴分离液上层 ，小心放入离心机，室温，离心2000rpm，15min 3）用塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞层于一新的离心管中，加生理盐水5ml (至管口1cm)，混匀后离心，2500rpm，8min 4）去上清，再次加生理盐水0.5ml，转入1.5ml的Ep管，2000rpm， 5min 5）留细胞沉淀于Ep管用于下一步的总RNA提取 ; 2、单个核细胞中总RNA的提取纯化：trizol-氯仿一步法 1）在留有细胞沉淀的Ep管中一次加入500ul变性液trizol（吹打混匀）、100ul氯仿，置于漩涡混合器上混匀，冰浴15min 2）4℃12000rpm，离心15min，吸取上层水相转入Ep 管中，加等体积的异丙醇，-20℃，20min 3） 4℃12000rpm，离心15min，去上层异丙醇，加入500ul 70%乙醇进行洗涤。4℃12000rpm，5min，倒去70%乙醇，留沉淀烘干。 4）用10ul DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，用于逆转录 ; 3、逆转录-- RT-PCR 1)反应体系： 25mM MgSO4 2ul 样品总RNA 1.25ul 随机引物 0.5ul dNTP（各10mmol/L） 0.5ul 2?beast Buffer 5ul Rnasin (20-40U/ul) 0.25ul DEPC处理水 补至 10ul 注：体系已配好，直接加入样品总RNA ;3、逆转录-- RT-PCR ;1、去除外源RNase的干扰:操作要戴口罩，仪器用具要用0.1%DEPC水处理后灭菌； 2、PBMC提取时，加入抗凝血，并且注意加入血液的方式，离心时试管要轻拿轻放； 3、吸取单个核细胞时要注意不要吸取其它液层;2）琼脂糖凝胶电泳： agrose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速???越慢，而且还与分子构型有关如质粒开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA 溴化乙锭（EB）能够嵌入 到DNA分子的碱基对中形成荧 光复合物，在紫外线激发下发 射荧光 ; 二、 实验原理3）T4DNA连接酶: DNA连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于ATP或 NAD+水解提供的能量，催化DNA的3’-OH与5’的磷酸基团生成磷酸二酯健。 T4DNA连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。; 二、 实验原理3）TA克隆：利用Taq酶在延伸过程中会在DNA的末端加A的特性，使PCR扩增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。;三、实验步骤;实验步骤;三、实验步骤;实验步骤;四、注意事项;;;;;32;33;34;35;;;; 碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。;;;43;质粒DNA小量提取： 一、收获 1）在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落，于37℃剧 烈振摇下培养过夜。 2）将1.5ml培养物倒入Ep管中，室温 8000rpm离心30s，收集菌体 3）弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥;二、碱裂解 4）加100μl用冰预冷的溶液Ｉ(GTE缓冲液）中，旋涡振荡器剧烈振荡 5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。 5）加200μl新配制的溶液Ⅱ（NaOH-SDS）。盖紧管口，快速颠倒Ep管5-10次以混合内容物。不要振荡，将Ep管放置于冰上5min。 6）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ（乙酸钾溶液）。盖紧管口，