基因敲除技术和ESPript经验交流.pptxVIP

经验交流 基因敲除技术和ESPript;一﹑苏云金芽胞杆菌的基因敲除技术;1. 基因敲除的原理——接合转移﹑同源交换;接合转移：是指受体细胞和供体细胞直接接触，质粒DNA直接从供体向受体转移的过程。 质粒分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的tra基因，质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。 有些质粒不含转移酶编码基因tra，但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含有tra基因的质粒诱动，这类质粒又被叫做可诱动质粒。 同源交换：含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。;genome;genome;2. 构建基因敲除载体;genome;;3. 第一次单交换实验操作;7)消质粒：然后以1:1000的比例转接，37°C培养6-8 h，重复3-4次，以消除未整合到BMB171基因组上的整合质粒； 8) 挑取单菌落：将7)中的菌液划线，挑取红色的单菌落于同样抗性的LB液体培养基中，28°C过夜培养; 9) 验证：抽取总DNA进行PCR验证第一次单交换的成功与否。 ;4. 第二次单交换;7) 抗性筛选。挑取步骤6中得到的单菌落，分别点板于两个不同抗性的LB固体平板 (抗性分别为Spc 300 μg/mL+Pmx 60 μg/mL和Kan