浅析细菌内毒素检测方法及常见问题.pptVIP

试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75％乙醇 常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 λ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值 * 灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。 试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)： 90EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/ml 0.2ml 1.6ml 0.2ml 1.8ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml * 0.2ml 0.2ml 1ml 1ml 1ml 1ml 水 水 溶解后的标准品 水 水 水 水 90 EU/ml 10 EU/ml 1 EU/ml 0.5 EU/ml 0.25 EU/ml 0.125 EU/ml 0.0625 EU/ml （2 λ） （ λ） （0.5 λ） （0.25 λ） * 2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。 1 2λ 2 λ 3 0.5λ 4 0.25λ BET水 2λ 2λ 2λ 2λ λ λ λ λ 0.5λ 0.5λ 0.5λ 0.5λ 0.25λ 0.25λ 0.25λ 0.25λ * 反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λc＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。） 当0. 5λ≤λc ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。 * 左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。 * 举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml: 平行管数 内毒素标准溶液浓度（EU/ml） NC 反应终点浓度C X (lgC) 0.25 0.125 0.06 0.03 1 + + + - - 0.06 -1.22 2 + + - - - 0.125 -0.903 3 + + - - / 0.125 -0.903 4 + + - - / 0.125 -0.903 λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml） λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。 * 方法学验证—供试品干扰预试验 目的： 确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。 影响因素： —新药检查方法建立； —鲎试剂批号或来源的改变； —检品生产工艺，配方，成分的改变； —检品关键成分来源的改变； * 方法学验证—供试品干扰预试验 供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVD＝CL/λ L:供试