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核糖体展示技术; 核糖体展示技术 (Ribosome Display Technology, RDT) 是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。运用此技术已成功筛选到一些与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质， 包括抗体、 多肽、 酶等， 是蛋白质筛选的重要工具。;原理; 启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等 。;产生; 这些研究结果说明，如果某种蛋白质的折叠不受核糖体蛋白通道的影响，那么与核糖体的解离就不是该蛋白获得天然构像的必要条件。1997年，Plückthun实验室在以上研究成果的基础上，对Mattheakis的多聚核糖体展示技术进行了改进，建立了体外筛选完整功能蛋白(如抗体）的新技术：核糖体展示技术。 ;操作步骤;2.体外转录和翻译 体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。 （1）对于含二硫桥的ScFv抗体(单链抗体）和其它蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好.。;（2）若分别进行,则需要控制RNase的影响。VRC—过渡态类似物—作为RNase抑制???,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响。;3.亲和筛选;①亲和筛选 分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。 ②mRNA的分离 筛选完后，加入含20 mmol/L EDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR(反转录PCR）反应重新引入T7启动子和SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。;4.体外分子定向进化 用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通 过易错PCR或(DNA shuffering)等方法引入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率。Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入DNA重排技术,又将其亲和力提高。;优势;问题;发展趋势及前景; 核糖体展示技术克服了传统筛选技术库容量小和筛选效率低等缺陷。该技术完全在体外进行,其文库容量不受细胞转染效率的影响,库容量和筛选效率得到很大提高,可与其他技术相组合,在体外分子高效表达和定向进化方面具有广泛的应用前景。;综上所述，核糖体展示技术，这种体外展示技术，以其无可比拟的文库容量和成熟简便的进化技术将得到越来越多的应用，显示出巨大的潜力。核糖体展示技术的应用和发展，可以使我们更加方便地根据需要来设计和筛选高亲和力抗体,蛋白,多肽,酶等，是具有应用前景生物筛选工具，在蛋白质相互作用,新药开发,卫生检验,食品工程等领域将发挥其重要作用。; Thank you