眼科学基础：分子克隆技术.pptVIP

DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体 重组DNA导入宿主细胞 转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 转染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 转导：以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 类型 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法（如CaCl2、RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 细菌转化及蓝白斑筛选 重组DNA的筛选与鉴定 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 限制酶切图谱筛选 PCR筛选重组体 DNA测序技术 4 1 2 3 重组DNA的筛选与鉴定方法 * 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长 平板筛选的种类 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上 插入失活 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌 蓝白筛选 载体 宿主 编码β-半乳糖苷酶N端序列 （IPTG存在） 编码β-半乳糖苷酶C端序列 α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落 蓝白筛选： lacZ基因 β-半乳糖苷酶 α互补 Figure 4.3 Genomes 3 (? Garland Science 2007) 测序 末端终止测序法 绿色荧光蛋白的发现者 下村修（Osamu Shimomura,日本籍） 1962年，第一次证明绿色荧光蛋白存在 ： 日本的下村修与美国的弗兰克·约翰逊在普林斯顿大学开展从维多利亚水母中分离纯化发光蛋白的工作时，成功地从水母中发现了两种发光相关蛋白质，水母素(Aequorin)和绿色荧光蛋白(Aeqourea Victoria)。 1974年，第一次获得了GFP： 下村修和约翰逊终于得到了GFP结晶，当时命名为绿色蛋白，后来称绿色荧光蛋白。 Osamu Shimomura于1962年在维多利亚水母（Aequorea victoria）中发现绿色荧光蛋白 GFP：green fluorescent protein 是目前应用非常广泛的细胞内蛋白质定位和示踪分子之一。 GFP含有238个氨基酸残基，分子量为27~30kDa。 不含辅基，无需底物或者辅助分子，可在蓝色光（450～490nm）的激发下，发射出稳定的绿色荧光（520nm）。 GFP的首次克隆并测序 1992年，道格拉斯?普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上 。 GFP第一次成为荧光指示剂 1994年，马丁?沙尔菲弃用GFP侧翼序列，而用PCR的方法扩增了其基因的编码区，将它转移到表达载体中，通过UV或蓝光激发，在细胞内产生了很美妙的绿色荧光。 马丁·沙尔菲（Martin Chalfie，美国籍） 第一个成功的GFP突变体 1995年，钱永健完成GFP突变。GFP的单点突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。 第一个荧光探针 1997 年，钱永健等发明了第一个 基于荧光蛋白的遗传编码的钙离 子探针。 钱永健（Roger Y, Tsien,美国籍） 经基因改造获得的由红至绿的荧光蛋白 Applications of GFP in cells 标记细胞 跟踪细胞 研究细胞骨架 GFP标记的微管 然后孟德尔的论文在当时没有引起科学界的注意。 威尔逊曾谦称：“我的最大贡献是发现摩尔根。” 没有分享摩尔根奖金的穆勒于1927年证明X光可以诱导基因突变 /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. 1 2 3 4 质粒载体 噬菌体载体 酵母菌质粒载体 动植物病毒载体 克隆载体 质粒载体