第二章 免疫组织化学技术.pptx

比较HE染色和免疫组织化学染色图象 （胰腺组织切片） H E 染色 胰高血糖素 IHC染色 胰岛素 IHC染色 生长抑素 IHC染色 Nissl’s staining show neuron in SN IHC Staining for TH in SN intact side lesioned side intact side lesioned side 第 2 章 免疫组织化学技术 是利用特异性抗原抗体反应，对组织细 胞的特定抗原（或抗体）进行定位和定量的 技术。 可在光镜或电镜水平研究生物大分子。 特异性强、灵敏度高而又直观化的原位 分析细胞组成物质的细胞化学手段。 免疫组织化学（immunohistochemistry) 免疫细胞化学（immunocytochemistry） 免疫组织化学 （immunohistochemistry) 免疫组化相关的组织学和细胞学技术 免疫酶组织化学技术 免疫荧光组织化学技术 亲和免疫组织化学技术 一、免疫组织化学相关的组织学和细胞学技术 特定抗原（或抗体）的显示和定位是 否准确与细胞和组织标本制备的质量好坏 有着密切关系。 因此, 组织和细胞标本的 取材和制备至关重要。 (一) 取材 (二) 固定 (三) 包埋和切片 一、免疫组织化学相关的组织学和细胞学技术 (一) 取材 组织标本的取材 活检钳、剪刀、刀片的刃口要锋利，以免组织 受挤压。 取所需器官组织：包括病变区、病灶与正常组 织交界区。必要时取远离病变区的正常组织 作为对照。 为充分保存组织的抗原性, 取材要快，尽量 保 持组织新鲜。 （4）组织块不要过大， 220.4 cm 2. 细胞标本的取材 印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 培养细胞涂片法 离心涂片机法 (1) 印片法 应用：活检标本、手术切除 的标本。 方法：将新鲜标本以最大面剖开暴露病区， 载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻 片上，立即浸入固定液中5~10min，取出 后自然干燥，低温保存。 优点：简便省时，细胞抗原保存较好。 缺点：细胞分布不均、重叠，影响观察效果。 应用：实质器官的病变区。 方法：①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。 ②穿刺液较多时，穿刺液滴入1~2毫升 Hanks液（或RPMI 1640液）内，轻搅，500rpm 离心5~10min，弃上清，制成细胞悬液（2×106 细胞/ml），吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固 定。 优点：细胞均匀。 缺点：细胞易变形。 (2) 穿刺吸取涂片法 (3) 体液沉淀涂片法 ①细胞数较多时，取一滴直接涂片。 ②细胞数较少时，取5毫升自然沉淀液 以1500rpm离心10min，弃上清，将沉 淀涂片，略干后固定备用。 (4) 培养细胞 ①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液 中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。 ②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成 涂片。 (5) 离心涂片机法 制备 2105~6/ml 细胞悬液， 取 50~100l ， 加 入 涂 片 机 内 ， 1000r/min， 2min，细胞即可均匀分 布于载玻片上。 取材的注意事项： ①为防止脱片, 应在载玻片上涂黏附剂 （详见后述）。 ②细胞取材时，为节省试剂及便于镜下观 察和计数，将细胞集中到直径0.6-1.0cm 圆圈内， 细胞总数以105为宜。 (二) 固 定 1. 免疫组化的固定法 免疫组化固定方法的原则: 最好地保存细胞和组织的形态结构; 最大限度地保存抗原的免疫活性。 固定分物理固定和化学固定： 物理固定: 如血涂片可采用空气快速干燥、冻结干燥 等； 化学固定： 浸润法（ immersion method） 将组 织浸泡在固定液中，必要时可在低温（4℃） 下进行，固定时间一般在3~12h。 灌流法 ( irrigation method ) 此法适 用于动物实验研究。将动物麻醉后，经动 物左心室主动脉插管，先用37℃生理盐水 灌流冲洗后，注入固定液，在30min内取 材，继之将组织浸入固定液中1~3h。 2. 重要的固定液 (1) 醛类固定剂 其可使组织间相互交联，将抗原保存于原位。 特点：对组织的穿透性强，收缩性小。 1）10％中性缓冲福尔马林： 甲醛10 ml+ 0.01mol/L PBS 90 ml（pH7.4） 易使组织硬化而致浸蜡困难，固定时间不宜过长。 2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液 ： 多聚甲醛40g+ 0. 01mol/L PBS 500ml（pH7.4） 加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使之完全 溶解，滴加1mol/L NaOH 数滴至溶液清亮为止，冷却后 加0.01mol/L PBS至总量1000ml。 适应性较广泛，因较温和，适于组织标本的较长时期 的保存。 3）Bouin’s液： 先将饱和苦