毒理基因组学.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交 学习文档 （二）疾病时基因组差异表达分析 某一疾病或综合征基因组与正常 基因组表达差异的比较。 学习文档 DNA芯片检测的差异表达谱 学习文档 （三）染色体制图定位及疾病相关基因克隆 疾病基因定位： 染色体原位杂交、染色体畸形分析、  连锁分析。 疾病相关基因的克隆： 已掌握疾病相关基因或及其产物的确切信息；已掌握与疾病可能相关的基因预测资料；对疾病相关基因毫无所知。 学习文档 疾病相关基因克隆策略： 功能基因克隆 候选基因克隆 定位基因克隆 定位-候选基因克隆。 学习文档 三、基因组学与肿瘤病因学 致癌因子引起DNA损伤，可引起突变， 如果关键基因功能改变，导致细胞异常 增殖而发生肿瘤。 学习文档 鉴定隐性癌基因（肿瘤抑制基因）和显性癌基因。 制图策略， 鉴定标志物。 学习文档 肿瘤基因组解剖工程，基因重排常导致癌基因失活。 / 学习文档 PCR聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction 是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法. 它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸 Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106万倍。 学习文档 1. 差异显示PCR: (Differential display reverse transcriptase-PCR,DDRT-PCR) 使用3’端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12亚份群体，这一过程叫差异显示反转录(DDRT). 锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有12种oligo(dT)12MN引物。 学习文档 基因表达序列分析（SAGE） SAGE技术是以转录子(cDNA)上特定区域 9～11 bp 的寡核苷酸序列作为标签(tag),来特异性地确定mRNA转录物,然后通过连接酶将多个标签(20～60个)随机串联形成大量的多联体(concatemer)并克隆到载体中,再对每个克隆进行测序。 应用SAGE软件分析,可确定表达的基因种类,并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度,构建 SAGE文库。 学习文档 SAGE方法的主要优点 由于SAGE标记物短小一致,PCR扩增(2个双标记物顺序连接作为 PCR的模板)的错误会减少到最小。因此这是一个高度敏感系统,可用于低丰度序列的确定。 SAGE的试验结果可以直接与发表在 SAGE map 表达数据库中的不同来源的数相比较。 SAGE可将基因表达的数据保留下来,作为数据库供当前或未来反复对比结果之用。 SAGE操作相对简便 ,任何一个具备 PCR 和测序仪器的普通分子生物学实验室都能使用这项技术 ,可在操作中采用锚定酶与标签酶的不同组合 ,更具灵活性。 学习文档 SAGE 的基本操作程序： 1.以特定细胞的总mRNA作模板加入5'端接有生物素的寡聚核苷酸oligo(dT)为引物及转录成cDNA，选用4碱基识别位点的限制酶（锚定酶，anchoring enzyme ,AE）酶切。由于锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制酶能够达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基(44).通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3'端部分。对每一个mRNA只收集其polyA 尾与最近的酶切位点只间的片段。 2.将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶(tagging enzyme,TE )酶切位点序列（标签酶是一种ll类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链），接头的结构为引物A/B序列+标签酶识别+锚定酶识别位点。 学习文档 SAGE 的基本操作程序 3.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA 片段约9-10个碱基，混合并连接两个cDNA 池的短cDNA 片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。 4.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片断并克隆测序。一般每一个克隆最少有10个标签序列，克隆的标签数处于10-50之间。 5.对标签数