SNP开发验证研究方法计划及技术路线.docxVIP

精品文档 精品文档 PAGE PAGE11 精品文档 PAGE 精品文档 SNP开发/考证的研究方法和技术路线 分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最中心的任务。 现在，我们没有任 何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要考证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。 1.1全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相关于Douglas体系，其操作简单，高通量。能够直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行剖析。在国家玉米改进中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果往常能够用来QTLs初定位，育种材料的群体区分与纯度鉴定以及低密度的关系剖析等。在此，我建议我们应当开发一套番茄基因型检测的芯片。 当前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因 SNP信息，包含7,720条探针。 而Affymetrix企业当前并没有相应的产品。可是经过跟Affymetrix企业认识，能够利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄当前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，可是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况邻近。此外，番茄作为自交植物， 其LD的衰减值应当更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们能够开发~3k芯片，应当能够知足大部分研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然当前下一代测序技术蓬勃发展，可是关于用于基因型检测来讲，其数据剖析与成真相关于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于 刚才发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展好多年的材料，芯片技术也在应用。 1.2全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并达成基因型剖析之后， 1）对 于优秀的QTLs或是基因，我们能够直接选择覆盖整个区间的分子标记运行 Douglas系统进行分子标记协助育种， 2）关于需要进一步考证的 QTLs，我们也 . 精品文档 能够利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。3）关于一些高信息量，均匀散布在全基因的SNP分子标记，能够用来建立番茄的指纹图谱。因此，一套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。 图1.1QTL区间上的SNP标记散布图 注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。 1.3Douglas系统下SNP标记的开发 经过成立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反响体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，进而建立番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，能够用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记协助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中精选高质量，高信息量的分子标记用于建立一套达成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。 供试材料： 22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（NoneTemplateControl），合计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。 关于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上考证。 DNA提取： 取~10mg植物组织，加入研磨介质和400μl裂解液，研磨5min，3000g 离心5min。 加入裂解液1/3体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g离心10min，吸取上清300~400μl加入到样品板中。 . 精品文档 按照下表在各96孔板中加入试剂： 板号 板型 板名 成分 样品及试剂体积 1 Microtiterdeepwell96plate 样品板（Lysis） 样品反响液 300~400μl 无水乙醇 400μl 2 Microtiterdeepwell96plate 洗涤板I（W1） PW 800μl 磁珠 30μl 3 Microtiterdeepwell96plate 洗涤板II（W2） 80%乙醇 800μl 磁套 4 KingFisher96KFplate 洗脱板（Elution） TE1.0 50~100μl 将各96孔板按仪器提示次序放入仪器中，运行程序。 程序运行结束后，将DNA溶液转移PCR板中并测量浓度（100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。 分子标记命名： 分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的改正与维护。比如： 名称 ID SNP位点 正向引物 反向引物 模板序列 SolBeckma