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如何根据要求自己设计 PCR引物 1 PCR 引物设计课堂笔记 ○ PCR 这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？ 今天我就来给大家用实例演示一下哈。首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对 合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA序列。 引物设计是 PCR的关键，附上 PCR的基本流程图： ○ 引物设计的原则： 1. 引物长度：一般为 15-30bp ，常用的是 18-27bp ，但不能大于 38，因为过长会导致 其延伸温度大于 74℃，即 Taq 酶的最适温度。 2. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱 基同源。 3. 序列 Tm值：引物的 Tm值一般控制在 55-60 度, 尽可能保证上下游引物的 Tm值一 致, 一般不超过 2 度。退火温度 =4×(G+C)+2×(A+T) -(5 ～8) 4.G+C 含量：有效引物中 (G+C)的比例为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上 下游引物的 GC含量不能相差太大。 5. 引物的 3′端：引物的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰；引物 3’端的 碱基一般不用 A，因为 A 在错误引发位点的引发效率相对比较高； 引物间 3’端的互补、 二聚体或发夹结构也可能导致 PCR反应失败 6. 引物的 5′端：引物的 5′端限定着 PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。 因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物 素、荧光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变 序列和引入一启动子序列等。 下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物： 2 用绿色荧光蛋白 (GFP)标记蛋白 NR1 ○ 简单点说，就是现在我们要把 Plasmid 2 中 GFP基因片段添加到 Plasmid 1 中的 NR1 基因片段上，但是 Plasmid 2 中 GFP基因片段本身并没有 BamHⅠ这个酶切位点，也就说我 们要在引物设计中人为地把 BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给 GFP基因片段，这样 PCR后 得到的 GFP基因片段就可以通过 BamHⅠ这个酶切位点进入到 Plasmid 1 中，然后绿色荧光 蛋白 (GFP)就可以来标记蛋白 NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白 NR1的目的，示意图见 下。 ○ 已知 NR1的编码序列 (~4000bp) ○ 红色为信号肽，蓝色为 BamHI酶切位点 , 下划线标出 BamHI酶切位点的阅读框 ○ 此次引物设计的要求： PCR扩增 GFP； GFP两边添加 BamHI酶切位点；保证 NR1的阅读 框不改变。 ○ 第一步：扩增 GFP基本序列 ○ 当终止密码子 TAA位于整个阅读框的中间位置时，我们需要把其去掉，否则就不能表 达全长融合蛋白了。 ○ 第二步：添加酶切位点， BamHI的识别位点（ ggatcc ） ○ 引物 1 与引物 2 是反向互补的噢 ~ ○ 第三步：保护阅读框（很重要） ○ 注意：紫色标注的就是一个阅读框，为了保证整个阅读框的完整性，此时我们发现引 物 1…g gat cc