第七章重组子的筛选与鉴定.pptx

基 因 工 程 原 理 Principles of Genetic Engineering; ;1.重组率;2. 转化率 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 重组子中存在非目的重组子。;由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。;重组子的筛选与鉴定 ;“选择”（selection）和“筛选”（screening）的基本含义;第七章 重组子的筛选与鉴定 ;一、 遗传检测法 ;1．根据载体表型特征选择重组体分子;(1)抗生素抗性基因插入失活选择;pBR322;（1）四环素：;选择过程：;;1.PBR322含Ampr和tetr，具有Ampr和tetr表型。 2.在tetr任何一个酶切点插入外源基因片断，都会导致tetr失活。 3.转化插入外源基因的PBR322的菌液涂布于含Amp的平板上，存活者必定是转化子。（Ampr） 4.将存活菌复印在含tet的琼脂板上，对照2个平板，凡在Amp平板上生长而在tet平板上不生长的菌落，必定是带有外源基因的重组子。;（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;更小的分子量和更高的拷贝数 β-半乳糖苷酶显色反应检测重组体 具有多克隆位点;;(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法;β-半乳糖苷酶法;?-半乳糖苷酶显色反应选择法;假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码（不破坏?肽）。;;;;（3）溶菌选择法;2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子;营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 ;;小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。;二 物理检测法;1.凝胶电泳检测法;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;;（3）PCR扩增检测法;菌液PCR;2.限制酶切分析法;酶切鉴定是必需的 1.限制性图谱个体特异性, 不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 2.同一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。 3.插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切 ???可鉴定载体及 ②插入片段的大小，方向，切后并电泳分析，以确定是否得到预期的重组DNA。 若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行序列测定。 若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。;EcoRI;筛选过程;3.R-环检测法;;三 核酸杂交法;核酸杂交通常采用一种带上放射性同位素或荧光标记的纯的单链DNA或RNA作为探针（probe），从一个大的未知的DNA或RNA群体中筛选到与之互补的同源DNA或RNA序列。 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。 ;核酸探针的来源：;（一）、核酸杂交流程;荧光标记法;（二）、杂交方法;1.原位杂交;;;2.斑点杂交;3.Southern 印迹杂交;胶上的DNA或RNA分子，必须通过毛细管或电导作用转移到滤膜上。 尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜;Southern blot 筛选结果;;Southern 印迹杂交的用途;4. Northern 印迹杂交（Northern blotting ）;Northern blotting;通过表达蛋白进行筛选;5. Western 印迹杂交（Western blotting ）;Western blotting;Western装置;② Blotting;1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。;④结果;方法;四 免疫化学检测法及其它;免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法（radioactive antibody test），和免疫沉淀测定法（immunoprecipitation test）。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。 Antibody can be used as probes Ligand（配体） can also be used as probes;;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;放射性抗体检测法过程;把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”(白色圆圈)。;2.免疫沉淀检测法;;3. Br