微载体最新分析和总结.pdfVIP

微载体 microcarrier 定义：细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是 透明的小颗粒。 能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长， 从而增加细胞 贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。是指直径在 60-250 μm，能适用于贴壁 细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 原理与操作 1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒 -微载体加入到培养容器的培养液中，作 为载体，使细胞在微载体表面附着生长， 同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。 贴 壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖， 要经历黏附贴壁、 生长和扩展成单层三个阶段。 细胞 只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关 键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。 细胞能否在微载体表面黏附， 主要取决于细胞与微 载体的接触概率和相融性。 2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接 触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着 于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢， 最大速度 75r/min 。 3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理 PH 值时， 表面带负电荷。 若微载体带正电荷， 则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。 若微载体带负电 荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁， 但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为 媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。 三个方面 ●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。 ●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附 的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 ●在培养环境中，如培养基组成、温度、 pH 、DC 以及代谢废物等均明显影响细胞在微 载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。 5. 微载体培养操作要点 ●培养初期： 保证培养基与微球体处于稳定的 PH 与温度水平，接种细胞 （对数生长期， 而非稳定期）至终体积 1/3 的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所 用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用 2-3g/L 的微载体含量，更高的微载体浓度需要控 制环境或经常换液。 ●贴壁阶段（ 3-8d ）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质 混合。 ●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数） 、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增 殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过 3d 左右，培养液开始呈酸性，需换液：停 止搅拌，让微珠沉淀 5min ，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（ 37℃），重新开 始搅拌。 ●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗 1 遍，然后加入相应的酶，快速搅拌 （75-125r/min ）20-30min 。然后解离收集细胞及其产品。 ●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或 原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至 4000L 以上。 生物反应器系统 此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性 因素包括： 细胞对剪切力的敏感性、 氧的传递以及传代和扩大培养等。 而研