RNA的变性电泳原理.docVIP

RNA的琼?脂糖凝胶电?泳 实验原理 RNA电泳?可以在变性?及非变性两?种条件下进?行。非变性电泳?使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RN?A条带也能?分开，但无法判断?其分子量。只有在完全?变性的条件?下，RNA的泳?动率才与分?子量的对数?呈线性关系?。因此要测定?RNA分子?量时，一定要用变?性凝胶。在需快速检?测所提总R?NA样品完?整性时，配制普通的?1%琼脂糖凝胶?即可。 基本过程同?DNA电泳?一样，但应明确一?点的是，因为RNA?分子对RN?A酶的作用?非常敏感，因此必须用?对RNA酶?有抑制作用?DEPC水?来配置所有?溶液，所有与RN?A接触的仪?器和装置都?要严格处理?以尽量减少?RNA酶对?样品的降解?；另外，因为RNA?分子有二、三级结构可?以影响其电?泳结果，因此电泳时?应在变性剂?存在下进行?，常用的变性?剂为甲醛和?戊二醛。 RNA非变?性琼脂糖凝?胶检测 实验材料、器具及药品? 蘑菇的总R?NA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检?测仪等。 琼脂糖，1XTAE?电泳缓冲液?，0.5μg/ml溴化乙?锭（EB）10X载样?缓冲液。 实验步骤 （1）用1×TAE电泳?缓冲液制作?琼脂糖凝胶?，加1×TAE电泳?缓冲液至液?面覆盖凝胶?。 （2）在超净工作?台上，用移液器吸?取总RNA?样品4 ul于封口?膜上。在实验台上?再加入5 ul 1×TAE电泳?缓冲液及1? ul 的10X载?样缓冲液，混匀后，小心加入点?样孔。 （3）打开电源开?关，调节电压至?100V，使RNA由?负极向正极?电泳，约30mi?n后将凝胶?放入EB染?液中染色5?min,用清水稍微?漂洗。在紫外透射?检测仪上观?察RNA电?泳结果。 非变性电泳?：上样量超过? 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液?时间太长，均可能导致? 28S 和 18S 条带分不开?。使用 2ug 上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的?电泳缓冲液?并且频繁混?匀两极的缓?冲液，是获得好的?电泳结果的?前提。(以 DNA 标准为参照?，28S 和 18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。) 变性电泳条?带变淡：EB 与单链的结?合能力要差?一些，故同样的上?样量，变性电泳比?非变性电泳?要淡一些。另外的可能?是甲醛的质?量不高。 RNA的变?性琼脂糖凝?胶检测 试剂： （1） MOPS缓?冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷?磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol?/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol?/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰?胺。 电泳槽清洗?：去污剂洗干?净（一般浸泡过?夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌?满——室温放置1?0分钟——0.1%DEPC水?冲洗。 操作： （1） 将制胶用具?用70%乙醇冲冼一?遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖?凝胶。 ①称取0.5g琼脂糖?，置干净的1?00ml锥?形瓶中，加入40m?l蒸馏水，微波炉内加?热使琼脂糖?彻底溶化均?匀。 ②待胶凉至6?0--70 ℃，依次向其中?加入9ml?甲醛、5ml 10X MOPS缓?冲液和0.5 ul溴化乙?锭，混合均匀。 ③灌制琼脂糖?凝胶。 （3） 样品准备： ① 取DEPC?处理过的5?00 ul小离心?管，依次加入如?下试剂： 10x MOPS缓?冲液2ul?，甲醛3.5 ul,甲酰胺（去离子）10 ul，RNA 样品4.5 ul,混匀。 ② 将离心管置?于60℃水浴中保1?0分钟，再置冰上2?分钟。 ③ 向管中加入?3 ul上样染?料，混匀。 （4）上样。 （5）电泳：电泳槽内加?入1XMO?PS缓冲液?，于7.5V/ml 的电压下电?泳。 （6）电泳结束后?，在紫外灯下?检查结果。 RNA提取?、电泳注意事?项，有几点说得?很好啊 快速的操作?，低温环境，少量取上清? 主要是抽提?之后吸取上?清时要特别?小心，只要不把蛋?白层吸出来?就不会有R?Nase污?染。 分子克隆第?二版343?页,上关于提取?RNA所用?的玻璃容器?的处理方法?,是用前18?0度干烤8?小时或更长?时间;另一种方法?是0.1%的depc?水浸泡(37度2小?时),然后灭菌水?淋洗数次,100度干?烤15分钟?,然后高压灭?菌除去de?pc.我们实验室?一直是用1?70度考4?小时,且不准离人?,不准过夜,可能是怕 烤箱长时间?高温,线路老化会?发生危险吧? 提取RNA?所用的枪头?，EP管。直接高压烘?干即可。如果用0.1％D