7重组体克隆的筛选和鉴定.pptxVIP

;第七章 重组体克隆的筛选和鉴定;一、抗药性标记及其插入失活选择法;;（1）四环素：;3. 选择过程：;;（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法;假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;二、酶切电泳筛选法;;;不同克隆的酶切结果;;三、PCR扩增检测法;1. 核酸杂交;二、核酸杂交检测方法;;;;;（2）R-环检测法;缺点：需要电镜！;2. Northern blotting;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2. 放射性抗体检测法过程;;;二、免疫沉淀检测法;;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;;2. ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;;3.ELISA的局限性;;; 蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。;(1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：;;②蛋白质电泳的分子量标准;;③凝胶中的蛋白质染色：;;（2）Western blotting;;② Blotting;;1）先用???抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。;④结果:;一、无细胞翻译系统;二、转译筛选;三、杂交抑制转译法;;四、杂交释放转译法;2. 过程;专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。;;第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法;②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用;④胸苷酸激酶的补救作用;① HAT培养基：;;真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。;DHFR+细胞;DHFR- 细胞;② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救;DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。;③ 氨甲喋呤“加压” ;是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。;③ 新霉素抗性基因--neor;含致死剂量G418的完全培养基。;CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。;在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。;二、植物转化体报道基因筛选法;2. 几种报道基因的作用原理;;;;;9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。4月-214月-21Thursday, April 8, 2021 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。07:36:2007:36:2007:364/8/2021 7:36:20 AM 11、一个好的教师，是一个懂得心理学和教育学的人。4月-2107:36:2007:36Apr-2108-Apr-21 12、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。07:36:2007:36:2007:36Thursday, April 8, 2021 13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成。4月-214月-2107:36:2007:36:20April 8, 2021 14、谁要是自己还没有发展培养和教育好，他就不能发展培养和教育别人。08 四月 20217:36:20 上午07:36:204月-21 15、一年之计，莫如树谷；十年之计，莫如树木；终身之计，莫如树人。四月 217:36 上午4月-2107:36April 8, 2021 16、提出一个问题往往比解决一个更重要。因为解决问题也