基因工程克隆载体09.pptx

基因工程载体与受体细胞 ;载体的概念 载体应具有的特性 载体的类型; 目的外源基因分离后，是无法自主进入到宿主细胞并进行复制表达的，必须有一个运载工具将其运达宿主细胞，才能达到复制、扩增和表达的目的;载体应具有的特性 ;; 在宿主细胞中具有尽可能多的拷贝数，以利外源基因扩增 在质粒非必需区有供外源基因插入的多克隆位点（multiple cloning sites, MCS） 具有一定的容纳外源基因的幅度，即容量 具有合适的选择标记 ; 载体的分子量要小：降低对转化率的影响；利于容纳较大的外源基因；拷贝高；易于分离；减少了不必要酶切位点 在细胞中稳定性高 易于从宿主细胞中分离、纯化和鉴定 质粒本身必须是安全的 最好具有广泛的宿主适应性、核酸序列背景清楚 ; 按其来源和本质可分为以下7种： 质粒载体(plasmid) 噬菌体载体 COS质粒（cosmid）。也叫粘粒载体。是质粒与λ的组合 噬菌粒载体（phagemid）是质粒与f1的组合 病毒载体　DNA病毒为主 人工染色体载体 穿梭载体（shuttle）; 按功能区分： 克隆载体：也叫转移载体，只起转运，扩增作用　　 表达载体：带有表达功能，即有启动子，可转录和/或翻译 测序载体：只产生单链DNA用于测序，如M13、T载体、U载体 转录及调控载体; 按照所需宿主细胞的类型分： 真核（表达）载体 原核（表达）载体 穿梭载体;质粒载体;质 粒;特 性; 2、拷贝数 严紧型（stringent plasmid）:低拷贝 松弛型（ralaxed plasmid）：高拷贝;3．质粒的不相容性（plasmid incompatibility）????两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用同一复制系统;4、生物学特性（分子标记）　质粒可以赋于宿主细胞不同的表型，如抗药性、结合转移特性、产肠毒素或溶血素等 质粒表型的表示法：F+/F-、Ampr/Amps、Tetr/Tets、Ampr/Tets、 Kanr、Strr、Cmlr、Neor ;5、质粒的转移和丢失（清除）　　 带有一个tra基因，可以自主地在宿主细胞间通过控制细菌配对和结合而发生转移的质粒叫接合型（conjugative）质粒，又叫自我转移性质粒。无此基因而无此功能者叫非接合型或非自我转移性??粒（no-conjugative plasmid） 非自我转移性质粒：R质粒、Col质粒 自我转移性质粒：F质粒及Ent质粒（可产生肠毒素）; 基因工程中由于使用非接合型质粒，因此质粒的转移需人工条件，一般是用化学（氯化钙）、物理（电击）或其它方法（脂质体）改变细胞膜通透性，使质粒DNA进入细胞，该过程叫转化; 质粒在自然条件下可从宿主菌中消失，或在人工条件下消失，这叫质粒的消除，俗称丢失。基因工程中质粒，特别是重组质粒的丢失是非常不幸的事 可促使质粒丢失的因素：吖啶橙、结晶紫、溴化乙锭、利福平、SDS、紫外线等;质粒载体的概念;质粒的基本条件;???? 选择标记基因：用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来 筛选标记基因：用于将特殊表型的重组子挑选出来;选择标记 ;筛选标记 ;;;筛选标记 ;质粒的基本条件;常用质粒载体;;; pGEM系列：多功能质粒载体是由pUC质粒改建而来。在多克隆位点两侧多了两个来自不同噬菌体的启动子，即T7和SP6启动子，可用于克隆、表达、转录及测序等。 ;质粒载体的受体细胞 ;（1）DH5α 具有α－互补作用，适用于多种质粒载体 （2）HB101　 无α－互补作用 （3）JM系列　 具有α－互补作用;噬菌体载体 ;;噬菌体载体 ;双链DNA噬菌体载体 ;; 野生型λ噬菌体基因组DNA 的MW为48Kb,所以包装上限：105% ×48Kb=51Kb 必须区段28 Kb，所以克隆能力为51-28=23 Kb;;; λ噬菌体作为载体的优点：a. 可容纳较大的外源DNA片段b.具有较高的感染效率c.由于λ能裂解宿主细胞，容易提取λ载体DNA或重组λDNA d.用λ载体组建的DNA或cDNA文库易于长期保存 ;柯斯质粒载体; 粘粒载体，由Collins和Hohn于1978年构建 Cosmid:cos site-carry plasmid,带有粘性末端位点的质粒。是人工构建的含有λ DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 特点： ①具有质粒和λ噬菌体载体的双重特点 ②可以插入较大的外源基因（31～45k