清热化瘀方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经干细胞增殖的影响_大鼠脑缺血再灌注模型.docxVIP

PAGE PAGE 1 清热化瘀方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经干细胞增殖的影响_大鼠脑缺血再灌注模型 　　 　　摘要：目的 观察清热化瘀方对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖的影响。方法 90只大鼠随机分为假手术组、模型组、清热化瘀组3组，采用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠（MCAO）模型，观察大鼠缺血损伤后缺血半暗带区的细胞增殖。采用免疫组化法观察脑缺血再灌注后2 d、4 d、7 d、14 d、21 d五个时间点巢蛋白（Nestin）及5-溴脱氧尿苷（BrdU）免疫活性的变化。结果 清热化瘀组大鼠在第2天、第4天、第7天的神经功能缺损评分明显优于模型组（P［1］的5级评分法进行神经功能评分，直至动物处死。 　　1.6 神经干细胞增殖检测 采用免疫组化ABC法。石蜡切片以1%H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液室温下孵育30 min，接着分别滴加1∶100稀释的小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体（Santa Cruz,USA）和小鼠抗大鼠 BrdU单克隆抗体（Chemicon,USA），4 ℃过夜，然后以PBS洗涤。再滴加1∶100的二抗生物素化兔IgG（武汉博士德），PBS冲洗，切片以ABC试剂盒按厂家说明进行处理。阴性对照用正常羊血清代替一抗。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1） 为广西自然科学基金项目（No.桂科自0832171），广西中医学院自然科学研究课题（No.G2021015） 　　1.7 细胞图像分析 用计算机图像分析系统软件计数脑梗死后不同时间段侧脑室室管膜下层（SVZ）阳性细胞数。每个动物随机选取相同位置的6张脑片，每个脑片在大鼠脑缺血半暗带随机选取6个视野 （×400），求得Nestin、BrdU阳性细胞的平均光密度值。 　　1.8 统计学处理 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，P［2］。随着再灌注时间的延长，表达不同特性的反应性神经干细胞开始增多，提示与神经细胞的修复有关［3］。Nestin是神经干细胞的特异性标记蛋白，随神经细胞的成熟而停止表达。神经干细胞发生分裂增殖后，与标记细胞增殖的药物BrdU结合，现在这两种指标被广泛用于神经干细胞的研究中。“毒损脑络”学说是中医中风认识上的新理论，认为中风发病是由于毒邪损伤脑络，络脉破损或络脉拘挛瘀闭，气血渗灌失常所致［4］。结合脑缺血损伤后 NSC的变化，认为脑缺血急性期产生的痰瘀热毒混杂脑内，损伤脑髓及脑络，NSC的增殖分化迁移之源受到抑制、破坏，导致神经功能缺损及功能恢复受限。因此认为，解毒通络是治疗大法［5］，据此理论而设的清热化瘀方，其功效为清热解毒化痰、活血化瘀通络，是治疗脑梗死的有效方剂，一系列研究表明其通过不同途径对脑缺血损伤组织具有保护作用，作为脑神经功能保护剂在临床运用有较好的疗效［6-8］。 　　本研究发现，假手术组缺血周边区均未见Nestin、BrdU表达。在脑缺血再灌注后的2 d、4 d、7 d、14 d、21 d时间点，模型组的缺血周边区均可以发现Nestin、BrdU蛋白阳性细胞，且在缺血再灌注7 d或14 d时表达呈高峰；清热化瘀组可以明显增加缺血周边区Nestin、BrdU蛋白阳性细胞的表达。说明脑缺血损伤后出现了一定的新生细胞自脑室旁向缺血脑区的迁移现象，但数量有限。而清热化瘀方可促进神经细胞增殖，从而发挥脑保护作用，这为其可以早期给药治疗提供了实验依据。 　　参考文献： 　　［1］ Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmann A，et al.Neurological impairment in rats after transient middle cerebral artery occlusion：A comparative study under various treatment paradigms［J］.Brain Res，2000，863（1-2）：94-105. 　　［2］ Holmin S，Von Gertten C，Sandberg-Nordqvist AC，et al.Induction of astrocytic nestin expression by depolarization in rats［J］.Neurosci Lett，2001，314（3）：151-155. 　　［3］ Pforte C，Henrich-Noack P，Baldauf K，et al.Increase in proliferation and gliogenesis but decrease of early neurogenesis in the rat f