14.1 PCR药物分析药物分析.pdfVIP

实时荧光定量PCR 技术 常规PCR 扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色、紫外光观察结 果，或者通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测，这不仅需要多种仪器设备，而且 费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭和丙烯酰胺等物质对人体又有害；这些繁杂 的实验过程还给污染和假阳性提供了机会。如果能在PCR 扩增结束后不打开反 应管盖即可实现扩增产物的检测，就可以克服常规 PCR 扩增的这些缺点。在此 基础上，美国Perkin Elmer 公司于1995 年开发了实时荧光定量PCR 技术。该技 术是一种核酸定量技术，通过对荧光信号的检测，实现了对PCR 过程中产物量 的实时监测，并可以精确计算出PCR 的初始模板量。因此，被广泛应用于生物 病原体检测、突变检测和多态性分析。实时荧光定量 PCR 只须在加样时打开一 次盖子，其后的过程完全是闭管操作，无需PCR 后处理，无须对样品进行电泳， 直接对反应管内的扩增产物进行检测；具有操作简单、速度快等优点。近年来， 基于这一检测原理，通过设计各种形式的探针，发展了多种检测 SNP 的技术， 如TaqMan 探针技术、分子信标技术和高分辨率溶解曲线检测技术等。 [1] TaqMan 探针技术 是由美国Perkin Elmer 公司于1995 年开发的一种核酸定 量技术，也是最早发展的一种实时荧光定量PCR 技术。探针的5′-末端和3′-末端 分别标记荧光基团和淬灭基团，两者能发生荧光共振能量转移而不产生荧光。在 PCR 反应过程中，Taq 酶的5′-核酸外切酶活性将与DNA 模板结合的探针降解， 使得荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。因此，可以通过检测 PCR 过程中或 PCR 之后产生的荧光信号来实现DNA 模板的定量。目前，该技术已被广泛用于 SNP 的检测。 TaqMan 探针技术测定SNP 的原理 分子信标技术（Molecular beacons ）是Tyagi 等在1996 年根据荧光共振能量 转移现象首次成功设计的，由于这种技术在单碱基变异检测中显示出了非常高的 特异性，两年之后，他们将这种技术应用到了 SNP 检测中。分子信标探针技术 具有PCR 技术的高效核酸扩增特性、核酸探针杂交的高特异性，以及荧光技术 的高灵敏性和可计量性。目前，分子信标法已被广泛应用于基因变异研究、病原 微生物的检测和肿瘤研究等多个领域。随着对分子信标特性研究的深入及新型分 子信标的出现，人们发现分子信标作为一种核酸探针，不仅适用于体外核酸分析， 而且也适用于活体分析。此外，该技术还可以用于蛋白质等能与核酸发生相互作 用的物质分析，是一种极好的研究蛋白质与核酸的工具。 分子信标技术检测SNP 的原理 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting, HRM ）技术是在熔解曲线法的 基础上发展起来的一种可用于检测 SNP 的新技术。该技术不需要标记探针就可 以快速准确地对SNP 进行分型；还可用于短片段重复序列的分析、序列匹配、 突变扫描、甲基化和RNA 编辑等方面的研究。该技术既可用于未知SNP 的分析， 也可用于已知SNP 的检测。高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP 的原理如 图13-3 所示，即通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物 的结合情况来实现。在PCR 反应时引入饱和荧光染料，荧光染料在 PCR 扩增 的过程中嵌入到DNA 双链中。当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧 光信号进行采集，绘制出 DNA 分子的熔解曲线。如果存在 SNP 位点，则会产 生SNP 位点不匹配的异源双链DNA ，该双链DNA 在升温过程中会先解开，荧 光染料从局部解链的DNA 分子上释放，呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度 （Tm 值），通过专业的分析软件可以快速确定是否存在SNP。 高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP 的原理 A ：原始熔解曲线，B ：归一化后的熔解曲线。