14.3生物质谱药物分析.pdfVIP

生物质谱技术 20世纪80年代产生的一些新的软电离方式，包括电喷雾电离(Electrospray Ionization)和基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 等，使得质谱能用于分析高极性、难挥发和热不稳定性生物大分子，生物质谱技 术也应运而生。目前此技术在基因组学与蛋白质组学方面已得到了广泛的应用。 MALDI-TOF MS 工作原理 A.离子化区 生物分子和基质形成共结晶，在脉冲激光照射后发生离子化B. 电场 加速区 离子束在电场中被加速，经过无电场的漂移管后以不同的速度到达检测 器，C.检测器 D.信号处理 目前国内外已有较多文献报道生物质谱在SNP 检测方面的应用，与其它检测 方法相比，它具有以下优点：（1）准确。因为它检测的是核酸的分子量（准确 地讲是荷质比）而不像其它方式检测的是一种衍生出来的变化。（2 ）快速。获 得一个质谱图只需要几秒钟。（3 ）高通量，耗费少。因为可同时检测多个位点。 （4 ）易于自动化。现在用于单核苷酸多态性研究的质谱技术主要是基质辅助激 光解吸电离-飞行时间质谱 （MALDI-TOF MS ）和电喷雾电离- 四极杆飞行时间质 谱（ESI-QqTOF MS ）。 单核苷酸多态性分析都由两个步骤组成：首先生成等位特异性产物然后对此 产物进行分析。目前生成等位特异性产物有4 种方法，即通过引物延伸，杂交， 酶切或链接反应的方式。这些方法都可应用于MALDI-TOF 质谱对SNP 的分析。 其中利用引物延伸反应是使用最广泛且简单的方法，此方法首先通过 PCR 将 DNA 进行扩增，然后立即与一条延伸引物在紧挨多态性位点的上游退火，dNTPs ， ddNTPs 和聚合酶也被加入反应体系中。延伸反应在多态性位点或多态性位点的 下一个碱基终止。引物延伸反应的产物由于延伸的碱基不同，分子量不同，经过 MALDI-MS 分析后即可区分SNP。 美国 Sequenom 公司开发的 Mass ARRAY 分子量阵列系统是目前唯一采 用质谱法直接检测SNP 的设备，能同时处理2 块基因芯片，实现高通量多重SNP 分析。平均每块芯片上可以进行384 个客户样本×15 个 SNP 位点的分型检测， 通过机械手的自动化控制和经过事先优化的处理程序，能确保每天实现 70000 个 SNP 基因分型的高通量筛选检测。而此基因分型系统正是结合了引物延伸反 应和先进的MALDI-TOF 质谱技术。 引物延伸反应应用于MALDI-TOF 质谱的SNP 检测 A.PCR 扩增 B. 引物延伸反应 延伸引物设计在紧挨多态性位点的上游 C. MALDI-TOF 质谱检测延伸反应的产物