分子生物学技术之DNA重组技术.pptx

第五章 分子生物学技术DNA重组技术及应用现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的重大事件三大成就：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。5.1 基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。（二）基因克隆的载体 我们知道仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还远远不能满足基因工程的要求，因为大多数 DNA片段不具备自我复制的能力，只有将他们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。载体（vector)是指具备自主复制的DNA分子，象病毒、噬菌体和质粒等相对分子量较小的复制子均可以作为基因导入的载体。载体三要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小（具有较小的分子量和较高的拷贝数）；插入位点多少（具有若干限制酶单一识别位点）；易于鉴定识别（具有抗菌素抗性基因）大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。?大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。AmpR优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；(iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ ’基因的功能。优点： 更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因，