评价大黄素-8-O-beta;-D-葡萄糖苷在体内外的遗传毒性.docxVIP

? ? ? ? ? 评价大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在体内外的遗传毒性 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 关键词： HepaRG细胞 二维培养 大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷 遗传毒性 肝脏是人体最主要的代谢及解毒器官，药源性肝损伤已成为药品监管机构关注的重点[1]。随着近年来临床不断出现含蒽醌类成分的中药致肝损伤的案例报道[2]，学界对蒽醌的肝损伤机制展开广泛研究。目前已有体外研究数据提示，蒽醌类化合物存在遗传毒性风险和致突变作用[3]。课题组前期研究中也证实大黄素可诱导正常人源肝细胞HepaRG染色体损伤和DNA断裂，在体外彗星及微核试验中呈阳性结果[4]。蒽醌类的潜在遗传毒性，尤其是肝脏肿瘤发生风险有待深入探索。 大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷是大黄素在体内的主要代谢产物及形式[5]，其原型同样存在于大黄、何首乌、虎杖、决明子、冬凌草等中药中且含量较高[6]。以何首乌为例，不同产地的何首乌药材中EG的含量最高可达0.42％[7]。文献报道EG可有效提高中枢神经系统中乙酰胆碱含量，保护神经元损伤，对阿尔茨海默病有一定改善，临床应用较为广泛。然而作为蒽醌类化合物，EG含有的羟基蒽醌结构属于遗传毒性警示结构，该结构与DNA碱基类似，使其可嵌入DNA链并导致沙门氏菌（尤其是TA1537菌株）回复性突变[8]。EG的遗传毒性风险不容小觑，但目前关于EG的毒性及致癌性风险缺乏充足的试验研究。 啮齿类动物在毒性研究中独具优势，但是大量开展体内动物实验成本较高且不符合替代毒理学减少动物使用的理念，因此，使用体外模型进行药物毒性初筛及作用机制的初步研究十分必要。HepaRG细胞是从慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌患者体内非瘤组织分离而得的细胞株，能表现人肝细胞的大多数功能，其体外二维培养模型是常用的体外肝毒性评价工具[9]。本课题组前期研究证实HepaRG细胞可在不额外添加代谢活化剂的情况下较好地代谢药物，在了解以肝脏为靶器官遗传毒性方面独具优势[10]。但2D模型缺乏细胞-细胞接触和细胞-胞外基质间的联系，长时间培养会出现生长抑制现象[11]。利用悬滴技术构建的三维HepaRG多细胞聚球体模型则可长期培养，并能够保持较高的白蛋白分泌水平和肝药酶活性[12]，从而更好地模拟药物体内代谢条件，提供更有价值的评价数据。 本研究同时利用体外2D、3D肝细胞培养模型和大鼠体内重复给药试验评价EG的遗传毒性，并比较3种评价结果的差异，以期为EG的临床合理应用和毒性评价方法的选择提供参考。 1、材料 1.1 仪器 悬滴GravityPlusTM和GravityTRAPTM板（瑞士Insphero公司）；VICTORX5多功能酶标仪（英国PerkinElmer公司）；5180R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；NTS-1300恒温振荡水槽（东京理化器械株式会社）；DYCP-31F电泳仪（北京市六一仪器厂）；CX41三目生物显微镜（日本Olympus公司）；eclipse80i荧光显微镜（日本Nikon公司）；Komet6.0图像分析系统（英国安道尔科技有限公司）。 1.2 药品与试剂 EG（成都普菲德生物技术有限公司，批号纯度：98.0％）；甲磺酸乙酯（批号：141970611309162）、细胞松弛素B（批号：2989720）、二甲基亚砜（DMSO，批号：RNBG7476）均购自美国Sigma-Aldrich公司；磷酸盐缓冲液（批号：A、RPMI1640培养基（批号：A、Giemsa染料（批号：SLBT6353）均购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶消化液（批号：1974026）、胎牛血清（批号：1908121）均购自美国Gibco公司；丝裂霉素C（日本东京化成株式会社，批号：AKZ8O-EF）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号；彗星分析试剂盒（美国Trevigen公司，批号：P191587）；Hanks平衡盐溶液（美国Corning公司，批号；SYBRGold核酸凝胶染液（美国Invitrogen公司，批号：1987319）；吖啶橙（美国Fluka公司，批号：930226）。 1.3 细胞 HepaRG人源肝细胞系购自美国ThermoFisherScientific公司，本试验所用细胞为第11～12代。 1.4 动物 SPF级SD大鼠30只，5～6周龄，均为♂。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。在恒温（20～26℃）、恒湿（40％～70％）、各12h明暗周期的条件下饲养。饲养密度为2～3只/笼。提供经钴60放射灭菌的鼠全价颗粒饲料