分子生物学导论--分子生物学实验技术.pptx

第12章 分子生物学实验技术(1); 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点的想象，否则，你对事物的观察就会受到影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的翅膀，否则，你就不可能走在别人的前面。——朱玉贤《现代分子生物学》;分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践，却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若一着不慎，即会陷入困境。 验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。 ——第一版前言（p11） 《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社;本次内容 一、核酸的提取、电泳检测 二、蛋白质双向电泳 三、PCR、RT-PCR;1、核酸的提取;1.1 植物基因组DNA的提取;将1 g叶片用液氮速冻后，迅速研磨成白色粉末，置入1.5 ml 离心管中； 加入600 ul 预热的cTAB提取液65℃水浴提取1 hr，其中每10 min颠倒混匀1次； 取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min； 6,000 rpm离心10 min，小心吸出上清夜； 将上清夜再用氯仿/异戊醇（24:1）抽提一次，离心后小心吸出上清夜； 加入2倍体积预冷的无水乙醇，温和颠倒数次，沉淀DNA； -20℃下放置30 min，或过夜； 用玻璃棒挑出DNA沉淀或6,000 rpm离心5 min； 70%乙醇洗两次，在无菌操作台上气干； 溶于200 ul灭菌的纯水； 取DNA溶液5 ul，稀释200倍，在260 nm下测量吸光值； 将DNA稀释成浓度为30 ng/ul的DNA工作液备用。;2.2 植物总RNA的提取与电泳 ;由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。 在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1?的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。 所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1? DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC处理。 注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！;植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。 rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。 mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴， 因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。 一般情况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。;提取植物RNA时，要注意的问题： 1）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞； 2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA； 3）抑制内源和外源RNase活性； 4）将RNA与DNA、蛋白质及其它细 胞成分分开。;苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA； 胍盐法：用异硫氰酸胍(或盐酸胍)和?-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀； 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。;QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍盐法。 即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制RNase活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。 加入乙醇后，再过第二个离心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出RNA。该柱子可结合100?g大于200bp的RNA，所以应控制起始材料的用量。;RNA提取步骤 （每一步均要求无RNase污染);加入700μl RW1缓冲液，10000rpm转速下离心25秒，弃去收集管； 将离心柱转移到一个新的2ml收集管上，加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃去管内液体重复使用收集管； 加入500μl RPE到离心柱内，最大转速离心2 min，干燥离心柱，弃去收集管； 把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管上，加入30～50μl 无RNase水（0.1%DEPC处理），10000 rpm离心 1min，洗出R