分子生物学导论--分子生物学实验技术.ppt

第12章 分子生物学实验技术(1-3);本次内容 一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;分 子 杂 交;类型;Southern and Northern blotting;Southern analysis;Southern bolt hybridization;播放动画： Southern. mov;本次内容 一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化;遗传标记的种类;用于标示目标基因的DNA序列。 与目标基因紧密连锁的DNA序列或者是基因内的一段序列。;分子标记的优点;分子标记的类型和特点;SSR;SSR的分布特点 不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。;SSR分析 两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。SSR分子标记的创制 基因组文库的构建——探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择——测序——引物设计——检测 Genome-SSR EST-PCR;PCR反应体系： DNA（20ng/μl）????4.0μl Primer（1mM）????0.25μl 10×Buffer???? ??2.0μl Mg2+（25mM）????1.2μl Taq酶（5U/μl）????0.1μl dNTP（25mM）????0.2μl 加水至20μl，混合后，进行PCR扩增 。;SSR的优点 两侧顺序保守，在同种间多相同； 数量丰富，在整个基因组均匀随机分布； 实验重复性好，结果可靠； 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异； 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子； 仅需微量组织，适合PCR??析半自动化 SSR的缺点 相对的物种专一性； 由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长； 实际分析时一般每次只分析单个位点； 不同引物退火温度不同，需要探索。;SSR的检测 琼脂糖凝胶检测 聚丙烯酰胺凝胶检测 由于1）SSR产物一般为几百bp；2）琼脂糖电泳很难区分几十bp的差异；3）变性PAGE配制比较复杂，因此，一般采用连续非变性PAGE电泳分离 (需要银染)。 凝胶配方如下：（1×TBE缓冲体系） 40%丙烯酰胺（Acr:Bis=39:1) 12mL 5×TBE 12mL 20% 过硫酸铵 600uL TEMED 30uL distliled water 35ml;1.抗病性鉴定和遗传分析;2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立;表2-1 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F2群体上的分离(Segregation between Yr5 gene and SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F2 population）;表2-2 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F3群体上的分离(Segregation between Yr5 gene and SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F3 population）;本次内容 一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化;遗传连锁图谱（linkage map）;1、染色体遗传理论 1903年W. S. Sutton和T. Boveri分别提出了遗传因子位于染色体上的理论，他们将染色体看作是孟德尔基因的物理载体。该理论亦称为Sutton-Bover