分子生物学导论--实验技术.ppt

第12章 分子生物学实验技术(3);1 基因文库构建 2 RACE技术 3 酵母单杂交法 4 酵母双杂交法 5 EMSA;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”; 目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 ↓ 文库的筛选（筛库） ↓ 含目的基因的克隆 ;基因组文库是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。 cDNA文库是利用从RNA序列反转录形成的cDNA序列构建的。 特殊序列文库是针对某些特殊基因或序列而建立的。;构建文库所使用的载体主要有： λ噬菌体(噬菌斑) 粘粒(菌落) 质粒 酵母人工染色体 (构建高等真核生物基因文库设计);基因组文库（Genomic Libraries） ; 建立基因组文库的一般程序 1．载体DNA片段的制备 DNA分离纯化 →限制酶切 → 脱磷酸化反应 2． 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化→机械剪切法 →分离特定大小DNA片段→酶法部分酶切完全酶切→分离特定大小DNA片段→供体与载体DNA连接 3. 供体与载体DNA连接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化） 5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。;基因文库的筛选;cDNA文库;mRNA在细胞中的丰度; 1. 基因特异性 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—15% tRNA 2. 器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同;3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同 4. 不均匀性 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。 ? 5. 各cDNA均可获得表达 （一般选用的载体都是表达型的）;(1)构建原理： RNA→cDNA→克隆 真核基因：内含子和特定的调控结构 采用构建cDNA文库是为了对某些真核基因进行研究;构建程序; 2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接 3） cDNA的定向插入 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。;cDNA的定向插入 ; cDNA文库与基因组文库的比较： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能