血红蛋白的提取和分离时.pptx

每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。两个α－肽链血红蛋白两个β一肽链四个亚铁血红素基团血红蛋白的特点： 一、血红蛋白的提取和分离1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识凝胶粒（一）凝胶色谱法（分配色谱法）根据 分离蛋白质的有效方法。相对分子质量的大小 凝胶是一些微小的多孔球体，由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成。当不同的蛋白质通过凝胶时原理：相对分子质量较小相对分子质量较大容易进入无法进入凝胶内部的通道凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面运动方式垂直向下移动运动速度较快运动路径较短洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部较慢较长后从凝胶柱洗脱出来4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。2.作用: 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。磷酸缓冲液 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)（三）电泳1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.电泳的类型：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳原理示意图阳极（+）阴极（—）带正电的离子带负电的离子带电性质以及分子大小，形状的不同分子迁移速度不同，从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳电泳检测结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）2.原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 （SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。3. SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少B 分子的大小C 肽链的多少D 分子形状的差异水 分血浆固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血液白细胞血细 胞两个α－肽链血小板血红蛋白（90％）两个β一肽链红细胞（最多）四个亚铁红素基团二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定知识回顾1. 血液有哪些成分？2.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 二、实验操作（一）蛋白质提取和分离步骤样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（二）操作过程1.样品处理： 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去