血红蛋白的提取与分离优质课.pptx

思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。一、基础知识：㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。收 集大分子收 集小分子 混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢㈡ 缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值3、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）㈢电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素?决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√1、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离2、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶蛋白质相对分子质量测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳①应用十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量②原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素③ SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS ,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的