苹果中多酚氧化酶最适-pH-的测定.docxVIP

。 实验二 苹果中多酚氧化酶最适 pH 的测定 一、实验原理 存在于果蔬中的多酚氧化酶（ polyphenol oxidase,PPO ）在适宜的条件下 能引起果蔬的酶促褐变。 因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。 多酚氧 化酶是一种含铜离子的酶， 它能催化两类不同的反应。 一是一元酚羟基化， 二是 - 二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻 - 二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻 -二酚作底物， 那么随着酶催化反应进行， 反应混合物的吸光值因邻 - 苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂： 0.2mol/L 醋酸 -醋酸钠缓冲液， pH 分别为 3.6 、4.0 、4.6 、 5.0 和 5.6 、 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液， pH 分别为 6.0、6.5 、7.0 、7.5 和 8.0 、0.01mol/L 儿 茶酚溶液、 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液， pH=6.5 、丙酮 仪器：组织捣碎机、抽滤装置、 721 分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃 仪器、离心机 三、实验步骤 1、从苹果中萃取多酚氧化酶 将 100 g 苹果迅速去梗和核后切成小块， 和 400mL 左右预先冷冻至－ 26 ℃ 的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（ 20,000 rpm ，2 min ），然后迅速抽滤， 保留滤纸上的沉淀部分， 将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去， 至沉淀无丙酮味。 将所得丙酮粉转移至 150 mL 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH 6.5 ）中，搅拌 30 min ，然后离心（ 4 ℃,10000 r/m,20 min ），离心所得上清液如有混浊，则用 8 -可编辑修改 - 。 层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。 2、不同 pH 下多酚氧化酶活力的测定 在比色皿中分别加入 1.8~1.1 mL pH 为 3.6 的缓冲液和 0.7mL 儿茶酚溶液， 搅匀后加入 0.5~1.2mL 多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在 400 nm 下的吸光值随时间的变化， 参比以缓冲液代替酶液。 依次测定 4.0、4.6 、5.0 、 5.6 、6.0 、6.5 、 7.0 、7.5 、8.0 几个 pH 。 四、数据记录与处理 数据记录： pH 值 3.6 4.0 4.6 5.0 5.6 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 加酶量 1.0 1.2 mL ） 10 ′OD 值 0.172 0.166 0.160 0.150 0.147 0.115 0.106 0.130 0.160 0.151 （12s （12s （ 12s （ 15s （ 11s （11s ） ） ） ） ） ） 20 ′OD 值 0.214 0.204 0.210 0.194 0.149 0.115 0.107 0.132 0.162 0.151 30 ′OD 值 0.258 0.250 0.258 0.240 0.152 0.115 0.109 0.134 0.163 0.151 40 ′OD 值 0.300 0.295 0.302 0.296 0.156 0.117 0.108 0.135 0.165 0.152 50 ′OD 值 0.341 0.338 0.348 0.329 0.161 0.117 0.110 0.136 0.166 0.153 60 ′OD 值 0.382 0.377 0.392 0.373 0.166 0.118 0.111 0.137 0.170 0.154 70 ′OD 值 0.420 0.418 0.433 0.415 0.171 0.121 0.113 0.139 0.173 0.156 80 ′OD 值 0.457 0.456 0.475 0.455 0.175 0.123 0.117 0.143 0.175 0.158 90 ′OD 值 0.494 0.494 0.514 0.496 0.179 0.126 0.118 0.143 0.178 0.161 100 ′OD 值 0.529 0.530 0.554 0.534 0.186 0.127 0.120 0.145 0.182 0.164 110 ′OD 值 0.565 0.567 0.591 0.572 0.188 0.130 0.121 0.151 0.184 0.165 120 ′OD 值 0.598 0.601 0.626 0.607 0.192 0.133 0.124 0.151 0.188 0.168 用 Excel 处理数据，得到不同 pH 下消光 - 时间曲线的斜率，斜率的物理意义即 -可编辑修改 -