第十章基因工程技术育种.pptxVIP

第九章 基因工程技术育种;★1、概念：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。;★2、诞生： 　1971年，美国Smith,H.O.　等分离出一种限制性酶，可酶切病毒的DNA分子； 　1972年：Ｂerg, P.　等实现不同酶切DNA片段的体外连接； 　1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA 转入大肠杆菌细胞并得以表达。 　;★３、基本过程：;;目的基因的分离与鉴定 ;★限制性内切核酸酶 (restriction enzymes)： 在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction )或阻止病毒侵染。 第Ⅱ类限制性酶： 　　能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列—回纹对称序列。;　载体 ;★作为载体DNA分子，需具备四个条件： ⑴具复制原点(ori)，能携带的外源DNA片段独立地自我复制； ⑵具有多克隆位点，即具有多种限制性酶的切点，用于克隆外源DNA片段； ⑶至少具有一个选择标记基因； ⑷易从宿主细胞中回收。 ;1. 细菌质粒 ;2. λ噬菌体 ;3. 穿梭载体 ;DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。;修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键;连接多个平头双链DNA分子：;目的基因与载体的连接(DNA分子重组) ;;重组DNA分子导入宿主细胞;转化;;(2)电穿孔法;转化子的鉴定 转化子的外源基因表达;★ 4. 基因工程的应用 ;◆胰岛素的人工生产;◆植物基因工程 ;◆转基因动物 ; ◆基因治疗 ;第二节 鱼类基因工程; 进入上世纪90年代，我国水产品总量已跃居世界首位，水产养殖产量超过捕捞产量，水产业的发展由捕捞型转向增养型。 其中，海水养殖的发展尤为迅速。相比贝类和虾类养殖，海水鱼类的养殖发展较慢。 制约因素较大的是越冬问题，多数海水养殖品种在4℃以上才能越冬，8 ℃以上才能摄食和维持缓慢生长。其次海水鱼的遗传育种和全人工繁殖育苗问题尚未彻底解决，育苗成活率较低。; 根据目前研究现状和发展趋势，海水鱼类基因工程的研究内容主要为： 分离和克隆海水鱼类中的有用基因; 筛选适用海水鱼类基因克隆和表达的载体及表达体系。 利用转基因技术，将外源基因导入海水鱼中，培育性状优良的转基因海水鱼类品系。;1. 海水鱼类基因的分离和克隆;抗冻蛋白基因; 上世纪80年代，加拿大Choy 等人发现了另一类抗冻蛋白。他们从产自北大西洋沿岸海域的美洲大绵鳚、冬鲽和杜父鱼中分离出3种类型的抗冻蛋白（AFP）。当AFP增至一定浓度，可以完全抑制冰晶的形成，因此即使在低于-1.7℃的低温条件下，含有一定浓度AFP的血清也不会冻结，这就是极地和北大西洋海域的海水鱼能够在严寒海水中生存的原因。; 用这几种抗冻蛋白基因构建的各种表达重组体已经成功地应用于转抗冻蛋白基因鱼类的研究和基因工程菌表达生产抗冻蛋白的应用研究。;2. 海水鱼类的基因转移; 鱼类转基因技术研究始于淡水鱼。1985年，我国学者朱作言等人首次报道了转基因鱼试验成功。他们将小鼠金属硫蛋白启动子-人生长激素基因组体（mMT-hGH）导入金鱼受精卵中，获得了第一批转基因鱼。海水鱼类的转基因研究直到90年代初才有报道，加拿大研究者成功地将海水鱼的生长激素基因和抗冻蛋白基因导入鲑科鱼类，培育出个体较对照鱼30倍的“超级鱼”和能够表达抗冻蛋白的转基因大西洋鲑。我国 研究者在世纪初也将海水鱼生长激素成 功导入我国重要的海水经济鱼类真鲷和 牙鲆，培育出生长速度明显加快的转基 因海鱼群体。 ; 鱼类作为转基因研究的实验动物，比哺乳动物等具有更多的优点： 鱼类怀卵量大，一次可产几万个至几十万个； 大多数种鱼类的卵子卵径大，卵质透明，便于进行显微注射等遗传操作； 鱼类是体外受精体外发育，易于进行人工受精和控制胚胎发育的条件。;2.1.显微注射法 显微注射法是目前最常用的方法，导入外源基因的成功率也比较高。主要包括两种方式： (1)卵母细胞的细胞核注射； (2)受精卵的细胞质注射。 ; 显微注射法的优点是外源基因的导入整合效率较高，缺点是需要贵重精密仪器，技术操作难度较大，并且外源基因的整合位点和整合的