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乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 摘要 冃的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的inHBsAg 冃的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的 in HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方 法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法： ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsA g标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6, 3, 1.5ng/ml3个 浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线 R2=0.997, 准确度97.07%, 1,5ng/ml的RSD为16.78%,不满足ng/ml级水平的RSD 一般应v15%勺要 求, 检测限LOD为0.172ng/ml,低浓度样品(1.5ng/ml)的检测在准确性和精密度方面 都低于高浓 HBsAg的 HBsAg的ELISA法定量分析试剂 盒不能用于临床标本的分析。 关键词：乙肝表面抗原ELISA定量分析方法学验证 前言 乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感 染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙 肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1] 肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义 [1]。ELISA法具有较高灵 敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检 测。目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒 HBsAg 的 HBsAg 的 ELIS A法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。 1.材料与方法 1.1试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品 1.2仪器 酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575 ；超纯水系统：Millipore Elix ；电 热恒 温培养箱（DNP?9052）上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）;移 液 器；Tip头；EP管。 1.3方法 .溶液配置 1XPBS 缓冲液的配置：称取 8gNaCI、0.2g KCk 1.44g Na2HP0和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸憎水中，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最 后 加蒸馅水定容至1L即可。 标准品的配置：原始标准品浓度为8ng/ml。。取6个2mlEP管，分别标记为S1?S6。 50ul/well5共1孔需50ul ,每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。 表1标准品的稀释方案 质控品的配置：50ul/well,共5复孔需250ul,配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标 记为C1, C2, C3,按照下表稀释方案进行稀释。 表2质控品的稀释方案 .铺板方案 取岀试剂盒中己包被酶标板，取岀板条，按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入 系列标准品、质控品及空白对照，每?孔50ul 空白对照加入1X瘀缓冲液 表3铺板方案 .加样步骤 加入酶标抗体，50 ul/well ,震荡。37°C电热恒温培养箱温育60min,取出后洗板4次，加 入A、B液，50 ul/well , 37C电热恒温培养箱温育15 min。加入终止液，50 ul/well o酶标板 放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件，选 择450nm波长(参照 波长630nm,设置LAYOU和报告模式，测定各孔吸收值。 2.结果 2.1标准曲线与线性范围 标准品理论浓度对应的实测OD值表4实测OD值 以HBsAg!论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系， 结果显示R2=0.9973,显示具有良好的相关性 Absorbance(OD) Conc(ngZml) 图1线性关系图 2.2准确度(回收率)的验证 质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表5实测浓度值 质控品做了 3个浓度梯度，每个浓度做了 5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行准确度 (回收率)的验证。表6准确度的验证 结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%, 113.07%,满足限度要求在 85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%,满足方法定量限在80%- 120%的范围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%,显示准确性好。 2.3精密度的验证 2.3.1板内精密度的验证 上表中RSD(%° 一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数 CV?, HBsAg 6ng/ml的 5个复孔的变异系数CV值为12.73%,显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合 ng/ml 级RSD