凝胶过滤色谱及填料.docx

7 号 B 座 931 室北京韦氏博慧色谱科技有限公司 7 号 B 座 931 室 北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 邮政编码： 100176 TEL ： 010AX ： 010凝胶过滤色谱及填料 北京韦氏博慧色谱科技有限公司 韦新桂 一、凝胶过滤 凝胶过滤色谱（ Gel filtration Chromatography ）是利用凝胶过滤色谱填料的网状结构根据分子量大小不同进行分离的一种方法。 它的分离原理是把分子量大小不的样品上样到色谱 柱中， 分子量大的分子不能通过扩散进入凝胶填料内部， 而与流动相一起先流出色谱柱。 较 小的分子可通过部分孔道、 更小的分子可通过任意孔道扩散进入填料内部。 这种颗粒内部扩散的结果， 使小分子向柱下的移动减慢， 从而样品根据分子大小的不同依次顺序从柱内流出 达到分离的目的。 凝胶象分子筛一样， 将大小不同的分子进行分离， 因此凝胶过滤又叫分子筛色谱或称尺寸排阻色谱（ Size-exclusion Chromatography ） 。 凝胶过滤具有许多优点：填料为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子作用，因此分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离从几百 到数百万分子量的分子； 设备简单、 易于操作，周期短， 每次分离之后不需再生故而可连续 使用，有的已连续应用几百次甚至达千次。 这些优点使凝胶过滤已成为一种通用的分离方法， 在生化产品的制备技术中已获广泛应用。 凝胶过滤主要有脱盐与分级分离两大用途。脱盐是分离大小两类不同的分子即无机盐 与生物大分子的； 分级是将分子大小相近的物质分开， 通常为大分子间的分离。 目前凝胶过 滤不但用于实验室，在大规模生产中也能承担重任， 30min 内可处理 500L 样品。脱盐工艺中凝胶填料体积通常为样品体积的 4～ 5 倍，流速可达 600cm/h 左右。用于分级分离时必须选用孔径适当、 分离范围与样品分子大小相适应的凝胶， 上样量少， 仅为床体积的 5% ～ 10%， 因此这种分离常用于经过浓缩后的样品。 柱的加长可提高分离效果， 但对操作不利。 在大规模分离中采用“叠式柱” （ Stack system），将几个不高的柱叠加起来，其易于操作，流速为 同样体积常规柱的 4～ 5 倍，且不影响分离效果。 二、凝胶填料应具备的条件 凝胶过滤是生物化学中应用最广泛的分离纯化技术之一，它具有设备简单、易于操作、 活性物质回收率高、 重现性好等优点。 凝胶过滤填料的性能是获取上述优点的基本保证， 凝胶填料应具备以下条件。 第一，填料本身为惰性物质，在应用过程中它不与溶质、溶剂发生任何作用。 第二，应尽量减少填料内含的带电离子基团， 以减少非特异吸附性， 提高蛋白质的收率。但由于绝大部分的多糖类骨架中都或多或少地含有一些带电基团 （如梭基） 等，这些基团在低离子强度时对带电荷的溶质发生作用， 将带正电的物质滞留产生非特异吸附。 对大多数分子而言，采用离子强度大于 0.02mol/L 的缓冲液即可消除这种效应。 第三，填料内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄，在分级分离中这点尤为重要。 第四， 凝胶珠粒大小均匀， 即粒径分布窄。为提高柱效， 根据实验目的及条件选用适合的粒径。细粒径分辨率高但流速慢，粗粒径适用于高流速、低压色谱及间歇操作。 第五，填料要具有优良的物理化学稳定性及较高的机械强度以增加使用寿命。 凝胶过滤填料在各种分离填料中占有特殊的地位。 由于它有上述优点、 能满足生化分离的基本要求， 将其经化学改性可衍生出种类繁多的色谱填料， 可以制备各种离子交换剂及缓 冲离子交换剂， 可以制备疏水色谱填料及螫合填料， 可以作为亲和色谱吸附剂的载体。 因此可认为凝胶过滤填料是各种色谱填料的母体， 所以研制新的凝胶过滤填料、 提高改进这类填料的性能有广泛的意义。 三、凝胶过滤填料的种类 凝胶过滤填料的骨架主要分为天然多糖类及合成大分子两大类。 多糖类骨架的填料 多糖类主要为纤维素、 葡聚糖及琼脂糖等。 以天然多糖为母体的凝胶过滤填料是 “经典” 的分离生物大分子的材料。 这类填料具有亲水性及与生物大分子的相容性， 可允许生物大分 子透过而不发生变性。这类填料原多为软基质，压力降大，不易操作。 近年来合成工艺不断 改进， 生产出刚性、 半刚性的骨架， 出现了适用于高流速且具有高分辨率的新产品以满足生 产规模的需求。 除单一的多糖骨架外还出现了琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶 Superdex 高效过滤填料。 新一代填料的出现， 提高了生产效率， 从小规模过滤发展成为工业生产应用。 这类以多糖为骨