转机因拟南芥的研究.docxVIP

? ? ? ? ? 转机因拟南芥的研究 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 关键词： 实验 拟南芥 转基因植株 遗传信息 遗传转化 一、实验材料 (一) 试验材料 转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。 (二) 试验试剂 本实验所需试剂主要有：Mu?rashigeSkoog（MS）培养基：M519（PhytoTechnologyLaboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni?col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwetL－77等。 二、实验方法 (一) 超表达载体的构建 采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNaseA和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12，000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；第六，向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT，12，000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；第七，重复步骤六；第八，将吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；第九，将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液TB，12，000rpm离心30s将质粒溶液收集到离心管中。进行质粒提取后，用两个内切酶BglII和PmlΙ分别对pGM－T－目的基因的质粒和pCAMBIA3301载体进行双酶切。加样结束后，混匀，37℃酶切10h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，且对目标片段及pCAMBIA3301骨架进行胶回收。然后，通过连接酶对目标片段和pCAMBIA3301骨架进行连接，构建重组表达载体。转化大肠杆菌Trans5α感受态，挑斑、摇菌，进行菌液PCR检测。挑取阳性pCAMBIA3301－目的基因克隆提取质粒，进行双酶切验证和测序。测序正确后，阳性pCAM?BIA3301－目的基因克隆质粒转化农杆菌EHA105感受态。 (二) 转化野生型拟南芥 1、野生型拟南芥的种植。野生型拟南芥的种植发苗有直播法和组培法。本实验中采用组培法。将野生型拟南芥种子播种于MS固体培养基（不含抗生素）上，待长出四叶一心后移栽至花盆中，具体方法如下：第一，MS培养基准备：M519粉末、蔗糖溶于去离子水中，终浓度分别为4.43g／L、30g／L，pH调节至5.8左右，后加入琼脂（终浓度为7g／L），于121℃，高压灭菌25min。待MS固体培养基冷却到不烫手的程度后，无菌条件下，将其分装到培养皿内，凝固待用。第二，种子消毒：（1）拟南芥种子（200~300粒）置于1.5mL的离心管内；（2）加入1mL75％乙醇溶液消毒1min；（3）吸出乙醇溶液，加入1mL的次氯酸钠溶液（Naclo∶ddH2O＝1∶5），振荡洗涤8～10min，短暂离心；（4）在无菌条件下倒掉消毒液，后用无菌去离子水冲洗5～6次。第三，播种：移液枪吸取已消毒的种子于无菌滤纸条上，使用无菌牙签点播至MS固体培养基上。株距1cm，行距1cm，播种完毕后，封口膜密封，4℃黑暗放置72h。第四，培养：平板至于培养室内，光周期为23℃光照16h，20℃黑暗8h培养7～10d。待植株长至四叶一心时，移栽至营养土里。第五，移栽：营养土使用前需121℃，灭菌30min。冷却后，营养土、蛭石按1∶1的比例混匀，除去杂质后装进小花盆放置于托盘内，向托盘内喷洒去离子水至表土湿润为止。 2、浸染。浸染液的准备，方法如下：（1）取检测结果为阳性的保存于－80℃的农杆菌菌液500μL于20mL含Chl（50mg／L）和Kan（50mg／L）的YEP液体培养基中活化培养；（2）28℃，220rpm，培养至培养基浑浊为止；（3）取以上菌液1mL于200mL含Chl和Kan的YEB液体培养基中进行继代培养；（4）28℃，220rpm，培养至菌液OD600值为1.0～1.2，不得超过1.2