《二代测序技术在医学领域中的应用》ppt课件模板.pptVIP

通过细胞形态富集 微流芯片 密度梯度离心 Plasma:血浆 Mononuclear cell：单核细胞（包括淋巴细胞、 单核细胞、 上皮细胞和肿瘤细胞） Ficoll：密度梯度液 RBCs：红细胞 免疫磁珠富集法 微流体 CTCs鉴定 流式细胞仪分析 (flow cytometry FCM) 免疫细胞化学技术 ICC（immunocytochemistry） 鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征，能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力 ICC是用能与显色剂结合的单抗与 CTCs特异性结合后，通过显色剂显色从而对CTCs进行鉴定的技术 通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常起源组织特异的候选基因的表达来检测 CTC, 灵敏度非常高但是坏死的癌细胞、上皮细胞污染等都可以造成假阳性结果，此法无法检测CTCs细胞形态，在临床应用上有局限性。  反转录-聚合酶链反应 RT-PCR SNP（个体间差异） CNV（大片段基因拷贝数变异） InDel SV（结构变异） 全基因组重测序的应用 SNP(SNV) 示例 为何研究SNP？ SNP目前已被公认为疾病发生的基因分子标记。 SNP被认为是导致药物差异化的主要因素之一，因此可以根据SNP的变化来进行个性化用药。 SNP分布广泛，且较为稳定。 某些SNP会直接影响功能基因表达。 大多数的SNP都是无用的 大多数的SNP属于沉默突变。 非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变。 但也有例外 诊断实例： Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。 Dr. James Gern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。 钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。 在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。 2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。 Kuroda, M., Katano, H., Nakajima, N., Tobiume, M., Ainai, A., Sekizuka, T., … Sata, T. (2010).. PloS One, 5(4), e10256. doi:10.1371/journal.pone.0010256 Nimblegen (Roche) SureSelect(Agilent) RNA Oligo Trusight (Illumina) 全外显子测序（WES） 癌症相关（人） 遗传性疾病（人） 其它非传染性疾病（人） 主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变 可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。 WES应用领域 成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据） 降低分析背景，容易发现稀有突变。 大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。 同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。 WES特点 WES方案流程 包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。 可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。 寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。 转录组测序(RNA-Seq) mRNA-Seq方案 有关lncRNA的一些知识： 长度大于200bp 无法编码蛋白 有内含子区和外显子区 非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。 所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对lncRNA的分析，并且发现了许多新的lncRNA。 lncRNA-Seq sRNA-Seq RNA-seq的优势 不局限于已知的基因