《蛋白质的修饰和表达》ppt课件模板.pptVIP

2、外源蛋白的表达方式 分为胞内表达和分泌到胞外两种 胞内表达适于在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白。 分泌表达一般为优先原则方式，因为毕赤酵母只分泌很低水平的内源蛋白，外源蛋白的纯化非常简便。 2021/7/26 3、表达产物的翻译后加工、修饰 毕赤酵母可以对蛋白进行翻译后修饰，包括信号肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、O-连接和N-连接糖基化修饰、磷酸化修饰等。 2021/7/26 4、影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素 （1）目的基因的特性 A、特定的A+T富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致只产生低水平或截短的mRNA。 B、外源序列中的mRNA5’非编码区的核苷酸序列和长度会影响核糖体40S亚单位识别的障碍。 C、某些稀有密码子是制约翻译速率的因素。 2021/7/26 （2）启动子的影响 常用的强启动子有AOX1、GAP、FLD1 这些强启动子有时会引起外源蛋白高水平表达，超过宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷量，引起蛋白的错误折叠、不加工或错误定位。可选择较温和的启动子，如PPEX8、PYPT1。 2021/7/26 （3）基因剂量 有些单拷贝的表达盒就可得到较理想的表达产量，有些提高拷贝数可大大增加表达水平，还有些增加拷贝数反而降低了表达水平。 因此，高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准，基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。 2021/7/26 （4）宿主、整合方式及转化子的类型 AOX1位点的双交换，可产生表型为Muts （甲醇利用慢）的菌落，单交换引起的基因插入，菌落表型为Mut+。 一般情况下，胞内表达最好选择Muts ，分泌表达，应尽量选用表型Mut+ 。但是，对整合位点、整合方式、转化子表型的选择应根据外源基因的特点和研究目的设计合理的技术路线。 2021/7/26 （5）影响蛋白质稳定性的因素 蛋白酶是一个重要因素。 提高外源目的蛋白稳定性的方法： 降低培养基的pH和培养温度，破坏蛋白酶作用的最适条件 培养基中添加蛋白胨和酵母提取物以增加蛋白酶作用的底物 选用蛋白酶缺陷型菌株做宿主菌进行表达 2021/7/26 （6）发酵条件的影响 通气量 碳源，常用甘油做碳源，但是碳源会抑制AOX启动子。一般采用甘油培养基使细胞达到一定浓度，再加甲醇诱导的，两步法来表达外源蛋白。 诱导时间 起始pH 添加特殊的营养物质 2021/7/26 三、昆虫杆状病毒表达系统 核型多角体病毒的多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因。 1、其缺失对病毒复制增殖毫无影响，可以作为外源基因理想的插入位点。 2、多角体蛋白被外源基因取代后，不形成多角体，在显微镜下可以与野生型相区别。 2021/7/26 （一）杆状病毒表达系统的原理 首先建立一个转移载体质粒，在这个转移载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列；然后将外源基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角蛋白基因启动子的控制之下；再将重组转移载体与野生型病毒DNA一起共转染昆虫细胞，外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。最后利用空斑形态形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染宿主细胞或幼虫，即可获得大量的外源基因表达产物。 2021/7/26 （二）杆状病毒表达系统的特点 1、重组蛋白具有完整的生物学功能 2、能进行翻译后的加工修饰 3、表达水平高 4、能容纳大分子的插入片段 5、能同时表达多个基因 6、适合表达细胞毒性蛋白 7、安全 2021/7/26 不足之处： 1、非连续性表达。重组杆状病毒能导致宿主死亡，所以每一轮外源蛋白的表达必须重新感染新鲜的培养细胞或宿主 2、其表达产物的糖基化相对简单，多不分支，糖侧链甘露糖成分高，缺乏符合寡糖。 2021/7/26 三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达 2021/7/26 1．哺乳动物细胞表达体系的优点 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。 2021/7/26 分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质网到高尔基体再