第四章基因工程的主要技术及其原理.pptxVIP

第四章 基因工程的主要技术及其原理第四章 基因工程的主要技术及其原理 第一节 DNA和RNA的提取和纯化 第二节 凝胶电泳 第三节 核酸和蛋白质的分子杂交 第四节 聚合酶链式反应技术 第五节 DNA序列分析 第六节 基因定点诱变 第七节 DNA与蛋白质互作分析 第一节??DNA和RNA的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。第一节??DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高 控制一定的pH值范围(pH值5-9) 保持一定的离子强度 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。第一节??DNA和RNA的提取和纯化 DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； 阴离子型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。第一节??DNA和RNA的提取和纯化 RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 肝素 复合硅酸盐（Macaloid) RNase阻抑蛋白（RNasin） 氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)第一节??DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂 DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 剧毒。第一节 DNA和RNA的提取和纯化一般程序 1、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库)一、DNA提取的基本原理与方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法一、DNA提取的基本原理与方法 基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH8.0） NaCl CTABβ-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 组份 Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入一、DNA提取的基本原理与方法 CTAB法流程图酒精沉淀植物材料裂解液液氮研磨抽提离心洗涤