食品安全检验综合实验指导书.docVIP

第 PAGE \* Arabic 15 页 年级： 系部及班级： 姓名及学号： 实验一 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 1 范围 本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。适用于食品中菌落总数的测定。 2 菌落总数 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL） 检样中形成的微生物菌落总数。 3 设备和材料 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 3.4 天平：感量为 0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 3.10 pH 计。 3.11 放大镜或/和菌落计数器。 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基：见附录 A 中 A.1。 4.2 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.2。 4.3 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.3。 5 操作步骤 5.1 样品的稀释 5.1.1 固体和半固体样品 称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min，制成 1:10 的样品匀液。 5.1.2 液体样品 以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。 5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 5.1.4 按 6.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。 5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 ~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 5.1.6 及时将 15 mL~20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 5.2 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。 5.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 5.3.1 选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 5.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 5.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 6 结果与报告 6.1 菌落总数的计算方法 6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。 6.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算： N = ∑ C÷(n1+0.1n2 )d 式中：N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 6.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 6.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 6.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 6.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间，其中一部