westernblot原理及操作流程1116.pptxVIP

2016-11-16;Western blot 定义;Western blot 原理; 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 ;Western Blot操作流程;水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。;蛋白样品的定量(Bradford法 );BCA蛋白浓度测定试剂盒; 20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本 ;;;四、Western Blot 转膜;Western Blot 的具体步骤;制作“三明治” “黑胶白膜”;Western Blot 的具体步骤;Western Blot 的具体步骤;五、封闭;六、一抗、二抗孵育;七、二抗与底物反应显色;Western Blot 需要的主要试剂;主要试剂;4. 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4℃保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4 ℃保存。 7． 5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8． 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。 （先加甲醇易产生沉淀）;9． 10XTBS缓冲液 Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。 10．1XTBST缓冲液 10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。 溶解后室温保存。 11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g 溶解后4℃保存，可于一周内使用。 ;WB需要试剂－膜;;主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分??情况，并可以转移到膜上。;WB需要试剂－一抗;杂交需要试剂－二抗;杂交需要试剂－底物;结果分析;;使用Photoshop 检测灰度值;;;;WB常见问题;标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题 转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker. 洗涤过度：减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间 一抗不工作：设置阳性对照 二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活：重新配制有效的底物;背景高;非特异性条带;Thank you！