一种构建分片段核酸文库的方法及其应用发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 109207471 A (43)申请公布日 2019.01.15 (21)申请号 201710527413.9 (22)申请日 2017.06.30 (71)申请人 深圳华大基因股份有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区洪安三 街21号华大综合园7栋7层-14层 (72)发明人 陈俊清　方俊彬　杨帆　钟宏斌　 刘娜　 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C40B 40/06(2006.01) C40B 50/06(2006.01) 权利要求书3页 说明书8页 附图9页 (54)发明名称 一种构建分片段核酸文库的方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种构建分片段核酸文库的方 法及其应用，具体涉及一种基于高通量测序平台 的分片段核酸文库构建的方法及应用，所述方法 包括如下步骤：(1)富集样本的核酸；(2)打断富 集产物；(3)加接头；(4)片段分离；(5)扩增；(6) 混合扩增产物。本发明通过在建库过程中，将不 同大小的核酸片段进行分离，分离的核酸片段分 别完成文库构建，分别插入不同片段大小的核酸 文库在制备DNB环节时，采用不同的滚换扩增时 间，实现其DNB上的单元循环数的均一化，也就是 使其测序时信号强度相对一致，最终提高数据分 布的均一性。 A 1 7 4 7 0 2 9 0 1 N C CN 109207471 A 权　利　要　求　书 1/3页 1.一种构建分片段核酸文库的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)富集样本的核酸，获得富集产物； (2)打断所述富集产物，获得片段化的核酸； (3)在所述片段化的核酸两端均加上接头，获得“接头-样本片段化核酸-接头”形式的 加接头产物； (4)对所述加接头产物进行片段分离，获得具有不同核酸片段长度的分离产物； (5)将所述分离产物分别进行扩增，获得多个扩增产物；以及 (6)将所述多个扩增产物进行混合，获得所述分片段核酸文库。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括提取样本的核酸， 所述核酸为DNA和/或RNA； 优选地，所述核酸的提取采用磁珠法和/或煮沸法提取； 优选地，所述富集采用PCR扩增的方法、或探针捕获的方法进行。 优选地，步骤(2)所述打断采用超声和/或酶切的方法，优选为超声的方法； 优选地，在步骤(3)之前，还包括对片段化的核酸进行末端修复，以及在3’末端添加碱 基A； 优选地，所述末端修复以及在3’末端添加碱基A的步骤为：将片段化的核酸与试剂I混 合后，在30-45℃25-35min，60-70℃10-20min，优选为在37℃30min，65℃15min； 优选地，所述试剂I为10×多聚核苷酸激酶缓冲液、dNTP、终浓度为5-15U/μL的T4多聚 核苷酸激酶、终浓度为5-20U/μL的Klenow酶、终浓度为1-15U/μL的rTaq聚合酶和终浓度为 1-10U/μL的T4DNA聚合酶，优选为10×多聚核苷酸激酶缓冲液、dNTP、终浓度为8-12U/μL的 T4多聚核苷酸激酶、终浓度为 3-10U/μL的Klenow酶、终浓度为3-10U/μL的rTaq聚合酶和终 浓度为2-6U/μL的T4DNA聚合酶，进一步优选为10×多聚核苷酸激酶缓冲液、d