一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法发明专利.pdfVIP

一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法发明专利.pdf

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一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法 技术领域 本发明涉及生物检测领域,尤指一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探 针组合、试剂盒及分型检测方法。 背景技术 新型冠状病毒2019-nCOV 属于Beta 冠状病毒属(Beta coronavirμs),Beta 冠状 病毒属是蛋白包裹的单链正链RNA 病毒,寄生和感染高等动物(包括人),其来源 于一种HKμ9-1 类似的病毒,在进化分支上,与SARS(导致2002 年“非典”)病毒和 类SARS(SARS-like)病毒的类群相邻,但并不属于SARS 和类SARS 病毒类群。该病 毒基因组长约30kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码 区,非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame,ORF)1a 和 ORF1b 基因,编码16 个非结构蛋白(non-strμctμralproteins,NSP),即NSP1~16。结构 蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M) 蛋白和核衣壳(nμcleocapsid,N) 蛋白。其中,N 基因、ORF1a 基因、ORF1b 基因、 E 基因等因其保守型较高,常作为新型冠状病毒核酸检测的靶点;而S 基因变异 为病毒进化的主要变异来源,常作为特定突变株核酸检测的靶点。 新型冠状病毒肺炎疑似病例的应从流行病学史和临床表现2 方面进行确定, 其中,临床表现如下:发热和(或)呼吸道症状等新冠肺炎相关临床表现;具有上 述新冠肺炎影像学特征;发病早期白细胞总数正常或降低,淋巴细胞计数正常或 减少。有流行病学史且符合临床表现任意2 条;或无流行病学史且新型冠状病毒 特异性IgM 抗体阳性且符合临床表现任意2 条;或无流行病学史且符合临床表现 全部3 条者,可诊断为疑似病例。新型冠状病毒肺炎疑似病例如满足如下病原学 或血清学证据之一,即:实时荧光RT-PCR 检测新型冠状病毒核酸阳性;病毒基 因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源;新型冠状病毒特异性 IgM 抗体和IgG 抗体阳性;新型冠状病毒特异性IgG 抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG 抗体滴度 较急性期呈4 倍及以上升高,即可诊断为新型冠状病毒肺炎确诊病例。核酸检测 是新型冠状病毒肺炎确诊标准之一,也是目前性新冠状病毒检测最常用、最有效 的检测方法。 自疫情爆发以来,新型冠状病毒便持续变异,世界卫生组织(WHO)曾通报了 自新冠病毒疫情暴发以来主要4 种病毒变异情况,分别为D614G 突变株、“Clμ ster 5”突变株、B.1.1.7 突变株和B.1.351 突变株。 B.1.1.7 共有23 个突变位点,其中,最重要的突变位点是位于S 基因上的 N501Y 突变位点、69-70del 突变位点和P681H 突变位点。N501 是S 蛋白受体结 合结构域(Receptor-Binding Domain,RBD)上的6 个关键氨基酸之一,有研究表明, 该位点突变可使得RBD 与受体ACE2 的亲和力增加,且已在小鼠模型中证明; 69-70del 突变位点有助于提高病毒的免疫逃逸能力,表现为降低部分血清的中和 敏感性;P681H 突变位点则有助于S 蛋白的切割,从而提高其与受体 ACE2 的亲 和力。 B.1.351 共有21 个突变位点,其中,最重要的突变位点是位于S 基因上的 N501Y 突变位点、E484K 突变位点和K417N 突变位点。E484 也是RBD 上的6 个 关键氨基酸之一,有研究表明,该位点突变可使得RBD 与受体ACE2 的亲和力增 加,并且可以增强病毒抵抗抗体的能力,目前已发现E484K 对C121、C144、2B04、 2H04、1B07、REGN-10989/34 等单克隆抗体都具有明显的抵抗作用;K417 也是 中和抗体的重要靶点,有研究表明,该突变可降低病毒与的亲和力,从而有助于 免疫逃避。 P.1 共有17 个突变位点,其中,最重要的突变位点是位于S 基因上的N501Y 突变位点、E484K 突变位点和K417T 突变位点。 为了满足对新型冠状病毒2019-nCoV 的B.1.1.7、B.1.351 和P.1 检测和分型需 求,亟需发明一种能够区分野生型和上述突变株的,并且准确和特异地检测出上 述突变株,并对其进行分型的核酸检测试剂盒。 发明内容 本发明提供一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分 型检测方法,将

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