一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法发明专利.docxVIP

一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法 技术领域 本发明涉及生物检测领域，尤指一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法。 背景技术 新型冠状病毒2019-nCOV属于Beta冠状病毒属(Beta coronavirμs)，Beta 冠状病毒属是蛋白包裹的单链正链RNA病毒，寄生和感染高等动物(包括人)，其来源于一种HKμ9-1类似的病毒，在进化分支上，与SARS(导致2002年“非典”)病毒和类SARS(SARS-like)病毒的类群相邻，但并不属于SARS和类SARS 病毒类群。该病毒基因组长约30kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区，非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame,ORF)1a和ORF1b基因,编码16个非结构蛋白(non-strμctμralproteins,NSP),即NSP1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(nμcleocapsid,N) 蛋白。其中，N基因、ORF1a基因、ORF1b基因、E基因等因其保守型较高，常作为新型冠状病毒核酸检测的靶点；而S基因变异为病毒进化的主要变异来源，常作为特定突变株核酸检测的靶点。 新型冠状病毒肺炎疑似病例的应从流行病学史和临床表现2方面进行确定，其中，临床表现如下：发热和(或)呼吸道症状等新冠肺炎相关临床表现；具有上述新冠肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数正常或减少。有流行病学史且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且新型冠状病毒特异性IgM抗体阳性且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且符合临床表现全部3条者，可诊断为疑似病例。新型冠状病毒肺炎疑似病例如满足如下病原学或血清学证据之一，即：实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；新型冠状病毒特异性 IgM抗体和IgG抗体阳性；新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高，即可诊断为新型冠状病毒肺炎确诊病例。核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊标准之一，也是目前性新冠状病毒检测最常用、最有效的检测方法。 自疫情爆发以来，新型冠状病毒便持续变异，世界卫生组织(WHO)曾通报了自新冠病毒疫情暴发以来主要4种病毒变异情况，分别为D614G突变株、“Clμ ster 5”突变株、B.1.1.7突变株和B.1.351突变株。 B.1.1.7共有23个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的 N501Y突变位点、69-70del突变位点和P681H突变位点。N501是S蛋白受体结合结构域(Receptor-Binding Domain，RBD)上的6个关键氨基酸之一，有研究表明，该位点突变可使得RBD与受体ACE2的亲和力增加，且已在小鼠模型中证明；69-70del突变位点有助于提高病毒的免疫逃逸能力，表现为降低部分血清的中和敏感性；P681H突变位点则有助于S蛋白的切割，从而提高其与受体 ACE2的亲和力。 B.1.351共有21个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的 N501Y突变位点、E484K突变位点和K417N突变位点。E484也是RBD上的6个关键氨基酸之一，有研究表明，该位点突变可使得RBD与受体ACE2的亲和力增加，并且可以增强病毒抵抗抗体的能力，目前已发现E484K对C121、C144、2B04、 2H04、1B07、REGN-10989/34等单克隆抗体都具有明显的抵抗作用；K417也是中和抗体的重要靶点，有研究表明，该突变可降低病毒与的亲和力，从而有助于免疫逃避。 P.1共有17个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的N501Y 突变位点、E484K突变位点和K417T突变位点。 为了满足对新型冠状病毒2019-nCoV的B.1.1.7、B.1.351和P.1检测和分型需求，亟需发明一种能够区分野生型和上述突变株的，并且准确和特异地检测出上述突变株，并对其进行分型的核酸检测试剂盒。 发明内容 本发明提供一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法，将针对新型冠状病毒2019-nCOV--B.1.1.7、B.1.351和P.1突变株分型检测的技术问题，以区分野生型和上述突变株，且能够准确的检测出上述突变株。 本发明提供的技术方案如下： 一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合，分别针对突变株上的S 基因上的5个突变位点设计的引物探针，引物探针如下： S基因上的N501Y突变位点的引物探针组:SEQ ID NO.1-3； S基因上的69-70d