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第六章 报告基因检测系统公司现已发展的有三种报告基因检测系统:NF-Kb,p53,NFAT.根据待检基因对其作用的原理,及在药物,抗体等作用下,产生的不同效果,这三种报告基因系统又具体可以分为:NF-kB 刺激系统和NF-kB 抑制系统;p53刺激系统和p53抑制系统;NFAT刺激系统和NFAT抑制系统.1. NF-kB 报告基因检测系统(NF-kB 刺激系统;NF-kB 抑制系统)1.1细胞培养1)细胞株及材料细胞株: 293-T细胞培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清) 培养器皿:T75(75cm2)培养瓶(以下相同),24孔细胞培养板2)细胞培养及铺板a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种293T至75 cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107个,可以按1:8分瓶.b) 铺板:细胞消化:将培养好的293 T细胞,倾去培养基,加入1-2ml1×胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS) 10ml左右,终止胰酶的消化作用,随后从中取少量细胞计数.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数,细胞密度的计算按照公式:细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数铺板: 24孔板按照每孔1.0105(NF-kB 刺激系统)或0.8105(NF-kB 抑制系统),接种体积为500L来铺板.细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.1. 2 转染1)试剂及材料:转染试剂:Lipofectamin 2000质粒: a:对照质粒:pEF-BOSTRAF6(NF-kB 刺激系统)Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统)b:NF-kB-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上2)转染:铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在A,B两个eppendorf管中分别加入:A:0.1g NFkB-luc reporter gene+0.4g interest gene+ serum free DMEM 至终体积50l/孔.B:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5minA,B二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100L,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.NF-kB 刺激系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:TRAF6,NF-kB 抑制系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN).(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)1.3 细胞收获及处理刺激因子:TNF(肿瘤坏死因子),母液浓度2g/Ml,使用浓度20ng/mlBuffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;NaCL: 50 mM;EDTA: 2 mM;MaSO4: 1 mM;DTT: 5 mM;Triton X-100:1% )1) NF-kB 刺激系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率,处理细胞.2)NF-kB 抑制系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率加药刺激:TNF用DMEM 培养基稀释后,200l/孔换液.加药刺激12-16小时后收细胞.3)细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,在摇床上振荡10-15分钟.置于冰上后,取出5l裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,可以马上上机,或放入-80C保存.1.4 luciferase 分析参见promega公司的TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面. 1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况见后.2. p53报告基因检测系统(P53抑制系统)p53刺激系统仍在优化之中,因此主要介绍p53抑制系统的操作步骤.2.1 细胞培养及铺板1)细胞株及材料:细胞株: Saos(p53-/-),细胞骨肉瘤