最新几种胶体金技术详解资料.pdfVIP

精品文档 胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方 向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价 格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较 快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验” 和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地 发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析， 主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为 标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最 初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合， 在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色 法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等 为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫 渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广 泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子 分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具 有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物 在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半 定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的 结果。因为在GIFA和GICA 中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析 时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金 快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA 中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸 附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复 合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌 A 精品文档 精品文档 蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记 免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC 膜，再用金标记抗体 或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。 金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜 上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。 胶体金的制备： 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的 排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白 磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中 氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法 为例。 Frens标准方法： （1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL. （2）约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， （3）继续煮沸约5分钟后结束反应。 （4）冷却后用0.1MK2CO3溶液调至所需PH值。 （5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依 然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。 附注：有研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素，制备过程中器具若全部使 用干净的玻璃器皿，溶液一律用0.2µm滤膜过滤后使用，水用玻璃三蒸水，推荐使用