人乳头瘤病毒基因（40）分型操作规程.docVIP

人乳头瘤病毒基因分型(40型)检测试剂盒标准操作规程 １　目的 　　明确人乳头瘤病毒基因分型(40型)检测试剂盒检测的操作规程，指导检验人员正确进行基因芯片检测。 2　　适用范围 2.1　适用于进行人乳头瘤病毒基因分型(40型)检测试剂盒检测的检验人员。 2.2　适合仪器：常规基因扩增仪、恒温杂交箱。 2.3　方法原理：采用PCR和DNA杂交相结合的DNA芯片技术。 2.4　样品要求：泌尿生殖道样本。 3 职责 　　实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4　试剂来源 　　《人乳头瘤病毒基因分型(40型)检测试剂盒》（昆明寰基基因芯片开发有限公司）。 5　质控物 　　阴性对照来源于试剂盒 6　检验方法 6.1 仪器和耗材 6.1.1 无菌操作台； 6.1.2 基因扩增（PCR）仪（适用0.2ml PCR薄壁管）； 6.1.3 取样器（0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl）； 6.1.4 台式离心机（转速可达12,000rpm）； 6.1.5 恒温培养箱（可恒温42℃）或可调42℃的保温台 6.1.6 水浴恒温振荡器（可恒温25℃）； 6.1.7 载玻片架及玻片洗脱容器2个； 6.1.8 芯片激光扫描仪(Axon GenePix4000B)； 6.1.9 PCR扩增所需一次性耗材。 6.2 检测前准备 6.2.1 芯片洗脱液配制（若10%SDS出现白色絮状沉淀，请于42℃条件加热至溶液透明后再使用） 6.2.1.1 在芯片洗脱容器中按照 蒸馏水（或纯化水）: 20×SSC: 10%SDS =100:5:1 配制洗脱液Ⅰ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片； 6.2.1.2 在芯片洗脱容器中按照 蒸馏水（或纯化水）: 20×SSC: 10%SDS =400:1:4 配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片； 6.2.1.3 洗脱液一次配制可连续使用15天，每个试剂盒中提供的洗脱液在一个月内用完。 6.3 样本处理 6.3.1 向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子； 6.3.2 将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min； 6.3.3 弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min； 6.3.4 弃上清，沉淀中加入100μl DNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min（误差不超过1min）； 6.3.5 震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为临床样本DNA； 6.3.6 取5μl阴性性参考品，加入50μl DNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min（误差不超过1min），震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为参考品DNA。 6.4 PCR扩增及标记 HPV检测按下表配制扩增-标记反应体系，按其循环参数在0.2ml PCR薄壁管中进行扩增和标记。 反应体系 循环参数 组份 加量（μl） 95℃ 5min×1 cycle; (94℃ 30s，42℃ 60s，72℃ 30s)×35 cycles; 72℃ 5min×1 cycle; 95℃ 5min×1 cycle; 4℃ ∞×1 cycle. 临床样本DNA或阴性参考品 5.0 PCR扩增试剂混合物 12.5 PCR扩增引物混合物 7.5 总体积 25.0 6.5 杂交 6.5.1 将恒温台或杂交箱开启升温恒定到42℃，用杂交模块将洗片固定好，预热10min。 6.5.2 将PCR 产物加热至95℃（置于PCR 仪中）变性5min,PCR 产物变性完毕取出后，立即冰浴3min。 6.5.3 取75μl经50℃预热的杂交缓冲液和25μl临床样本扩增-标记产物充分混匀，将混合物全部滴加在芯片矩阵位置，（操作过程中禁止触碰到微阵列区，避免产生气泡）； 6.5.4 将保湿杂交盒水平放入42℃，恒温台上或恒温箱内杂交40min。 6.6 洗脱 将芯片放入洗脱容器中，在25℃恒温水浴摇床100rpm震荡条件下进行洗脱。洗脱流程：洗脱液Ⅰ，5min；洗脱液Ⅱ，5min。洗脱完毕后，将芯片自然晾干或用专用的玻片离心机甩干即可进行扫描。 6.7 扫描及结果判定 6.7.1 将干燥后的芯片置于激光扫描仪中使用532nm波长激光扫描（按说明书操作），获得扫描数据及图谱； 6.7.2 按照说明书要求对检测数据进行分析，生成检测报告（为简化操作，数据判读可采用数据辅助分析软件进行）。 【参考值】 7判定值 7.1.1 芯片探针布局如图2所示，其中P为定位点，buffer 为空白点，NC为阴性参考点，PC为阳性参考点，IC为提取对照点，HC为杂交对照点，6为人乳头状瘤病毒6亚型的检测探针；11为人乳头状瘤病毒11亚型的检测探针；16为人乳头状瘤病毒16