临床样本的采集、运输和保存及核酸提取.pptxVIP

临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取 研究背景 样本的采集、处理 样本的保存 样本的运输 DNA的提取 RNA的提取研究背景一、样本的采集、处 理、保存及运输临床标本的正确采集、运送、保存的重要性临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一（一）、样本的采集地贫检测样品采集： 外周血: ≥5mL 脐带血: 0.5~1mL 羊 水：20～30mL 绒 毛：≥15mg 唾 液 组 织标本采集的注意事项所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送采集足够量标本每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息全 血以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠，不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测，可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA血清（浆）DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下 肝素的作用机理 肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用每μg核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸在于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 ℃下作用2小时可去除肝素的抑制作用（二）、样本的运送 样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本中如加入了适当的稳定剂，如用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄建议：将全血标本或DNA样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取RNA的样本需预处理后加lml Trizol在低温运送（三）、样本的保存常规外周血标本，采集后做血常规，常温24小时内，4℃可保存1周；做血红蛋白电泳常温1周，电泳4℃可保存15天；DNA提取样本常温24小时，4℃保存1个星期， －20 ℃保存3个月，－70 ℃保存半年～3年；RNA提取样本常温6小时，4℃保存12小时， －70 ℃保存3个月，羊水在12小时内离心可保存同上。研究背景 二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否临床PCR检验操作中最易出问题的环节（一）、提取核酸总的原则保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也应尽量去除。（二）、核酸提取的基本步骤1、核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 Ⅰ机械法1.匀浆法机体软组织2.捣碎法动物韧性组织3.研磨法细菌、酵母 Ⅱ物理法1.超声法细胞混悬液2.反复冻融法培养细胞3.冷热交替法细菌、病毒4.低渗裂解红细胞 Ⅲ化学法1.有机溶剂细菌、酵母、血液2.去垢剂组织、培养细胞、血液3.酶解法细菌、酵母、血液2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤 4. 核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定浓度鉴定DNA：1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸）RNA：紫外吸光光度法: A260×稀释倍数×40＝ μg/ml(OD260-OD320)×稀释倍数×40＝ μg/ml 2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸