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基因工程期末考试 一、蓝白斑筛选方法 答:蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。 有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色 变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖 苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码 β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链)，从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括:一段β-半乳糖苷酶的启动子;编码α肽链的区段;一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的,端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-,-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA(即目的片段)与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出:未转化的菌不具有抗性，不生长;转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落;转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 二、差异杂交 答:差异杂交(differential hybridization)是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物(如酵母)表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物，则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低(仅5,左右)，价值不大。 三、星号活性 答:含义:在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性，如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性:Apo I、Ase I、BamH I、BssH II、EcoR I、EcoR V、Hind III、Hinf I、Pst I、Pvu II、Sal I、Sca I、Taq I、Xmn I。 酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有:单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻。Polisky等对EcoR I的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列;最近， Gardner等的研究表明，只要识别中心的四碱基序列(AATT)不出现A/T替换，EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。 大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。 导致星号活性的因素 较高的甘油浓度(5% v/v); 酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同，通常为100 U/micro;g); 低盐浓度(25 mM) 高pH值(pH 8.0) 存在有机溶剂(如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等) 用其他二价离子替代镁离子(如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等) 以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。 抑制星号活性的方法 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染。 将离子浓度提高到100-150 mM(若酶活性不受离子强度影响)。 将反应缓冲液的pH