基因工程制药的下游技术.ppt

亲和层析 亲和层析(affinity chromatography，AC）是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除 * ppt课件 亲和色谱是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时也可用于某些生物大分子结构和功能的研究 * ppt课件 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography）又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。填料有一定大小范围的孔径，大分子进不去先洗脱，小分子进入孔径而后被阻滞，不同的蛋白质根据它们大小和形状的不同在层析柱中被分离 * ppt课件 优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性等 缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间 * ppt课件 广泛用于蛋白质(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化 用于蛋白质相对分子质量的测定、脱盐、样品浓缩等 * ppt课件 （六）、非蛋白质类杂质的去除 DNA的去除：离子交换层析、亲和层析、疏水层析 热原质的去除：最好的方法是防止产生热原质，阴离子交换层析法，疏水层析法，亲和层析法（多黏菌素B） 病毒的去除：色谱分离、紫外线照射和过滤 * ppt课件 根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接选择 根据分离纯化工艺的要求来选择 （七 ）、选择分离纯化方法的依据 * ppt课件 7.1 根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物：浓缩处理（沉淀和超滤） 可溶性表达产物：亲和层析，离子交换 周质表达产物：低浓度溶菌酶处理后，采用渗透压休克的方法 * ppt课件 包含体：对蛋白质分离纯化有两方面的影响，一是它可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白纯化较容易完成；另一方面产物经过了一个变性复性过程，较易形成产物的错误折叠和聚合体 * ppt课件 选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效分离手段，将含量最多的杂质先分离去除，将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段 7.2 根据分离单元之间的衔接选择 * ppt课件 先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质 随后采用高分辨率的操作单元，如离子交换色谱和亲和色谱 最后选用分离规模小、分离速度慢的操作单元如凝胶排阻色谱，可以提高分离效果 * ppt课件 色谱分离次序的选择 经盐析得到的液体不适宜于离子交换层析，可直接应用疏水层析 离子交换色谱之后进行疏水层析比较合适 亲和层析多放在第二步以后 凝胶过滤色谱放在最后一步 * ppt课件 要具有良好的稳定性和重复性 要尽可能减少组成工艺的步骤 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整 7.3 根据分离纯化工艺的要求来选择 * ppt课件 在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量 工艺时间要尽可能短（生物活性收率会降低） 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低 具有较高的安全性 * ppt课件 三、 基因工程药物的质量控制 * ppt课件 1983年美国FDA制定“重组DNA生产的药品、生物制品生产与检定要点” 1988年与1990年欧共体分别制定“基因重组技术医药用产品生产与质量控制”、“生物技术医药产品临床前生物安全性试验要求”与“生物技术生产细胞因子的质量控制” * ppt课件 1990年中国卫生部相继颁发“人用重组DNA制品质量控制要点” 1991年世界卫生组织正式公布“重组DNA生产的药品生物制品的生产和检定要点” 2000年中国颁布执行《中国生物制品规程》 * ppt课件 （一）、医药生物技术产品质量保证要点 产品安全性评价：临床试验 产品本身的结构：药理学、毒理学研究 严格控制条件：从原料到制成品制备全过程的每一步都须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效 * ppt课件 （二）、生物材料的质量控制 原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定 目的基因，表达载体，宿主细胞 * ppt课件 （三）、培养过程的质量控制 在贮存中，要求种子克隆纯而稳定 在培养过程中，要求质粒稳定，始终无突变 重复生产发酵中，工程菌表达稳定 始终能排除外源微生物污染 * ppt课件 （四）、纯化过程的质量控制 分离纯化过程质量控制要求：保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带人的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规