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学习好资料 欢迎下载 第一 章 一、电泳 电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电 荷性质相反的电极移动 .移动速度称为电泳迁移率。 影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目 成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3 当电场强度一定 ,电泳介质相同 ,电荷相同的分子在电场中迁移的速 度主要取决于分子本身的大小和形状 (构型 ) 。 4 分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关 : 分子量越大， 移动越慢。 指示剂： 溴酚蓝（ Bb） ：常用指示剂。分子量 670，分子筛效应 小，近 似于自由电泳，呈蓝紫色。 二甲苯青 (Xc) ：分子量 554.6， 呈蓝色，迁移速度比 Bb 慢。 染料：溴化乙锭（ EB ） 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收 DNA 样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保 存；能装载的 DNA 量大，达每孔 10 μgDNA 。 2 、SDS原理： SDS 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白 质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。 SDS 与蛋白质结合使蛋白质构象改变， 成为形状近似雪茄状的长椭圆 棒， SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。 学习好资料 欢迎下载 蛋白质 -SDS 复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影 响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。 二、 PCR 技术 定义：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以 DNA 为模板，在引物、 dNTPs、Taq 酶的作用下，经变性－退货－延 伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR 法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过 PCR 扩增而获得定点突变的基因或 DNA 片段。 影响因素： （1）Taq DNA 聚合酶 （具有5’ 3’聚合酶活性和 5’ 3’ 外切酶活性，但没有 3’ 5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配 对）。 （2）引物（ primer ）一般引物设计为长 15—30bp；位置与待扩增的 模板 DNA 区段的两 3’端序列互补（ 5 端相同）的短‘ DNA ；引物的 碱基组成：尽可能提高 G+C 含量，避免连续相同碱基排列或内部回 文序列，避免形成引物二聚体。 （3）引物的 Tm 值：实际复性温度选择低于 Tm 值 5 oC。 （4 ）dNTPs 含量适中 （5）Mg 2+ 的浓度 （6)对照实验 三、 PCR 技术的扩展：反向 PCR：不对称 PCR：差异显示 PCR。 反向 PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序 列 “转变 ”成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA ， 学习好资料 欢迎下载 然后用连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向 PCR扩增引物的 上游片段和下游片段。 不对称 PCR：用于扩增单链 DNA ，单链 DNA 更适于测序。 mRNA 差别显示技术：对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离 的有效方法之一。将