邻苯二甲醛对还原型谷胱甘肽的光谱分析——推荐一个仪器分析实验.docxVIP

邻苯二甲醛对还原型谷胱甘肽的光谱分析——推荐一个仪器分析实验 仪器分析是化学学科的重要分支，主要是借助特殊仪器，以物质的理化性质为基础建立起来的分析方法。它具有分析能力强、分析速度快、检测灵敏度高等优点还原型谷胱甘肽(GSH)是一种含巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，在体内协助维持机体的免疫系统，并具有抗氧化性和解毒功能。因此，对GSH含量的检测可为疾病的诊断和健康评估提供有效的数据。目前GSH的检测方法主要有还原酶法、量热法、分光光度法、色谱法、毛细管电泳法等。与之相比，光谱分析法，尤其是荧光分析法，可在生物体中实现无创原位成像分析，具有良好的生物应用前景。因此，开发可用于GSH检测的光谱分析方法引起了广泛的关注近几十年来，有机分子探针的设计与检测性能研究获得了长足的发展，尤其是紫外-可见吸收光谱法(比色法)和荧光光谱法本实验采用商品化的试剂邻苯二甲醛(OPA)作为探针分子，避免了探针分子的合成与分离，保障了实验教学在有限课时内顺利实施。实验内容包含标准溶液的配制、紫外-可见吸收/荧光光谱测试、检测限的计算、结合比的确定及分析机理的验证(包括核磁共振氢谱和高分辨质谱)等几部分。本实验适用于化学及相关专业高年级本科生的教学，使学生体验科学研究的趣味性与严谨性，培养正确的科学态度，为后续的继续深造和就业打下基础。1 实验部分1.1 实验目的(1) 掌握紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计的基本操作。(2) 掌握分子探针法对分析物的测定方法。(3) 学习动态弱相互作用的光谱分析方法。(4) 学习核磁共振波谱仪和质谱仪的使用。(5) 掌握实验数据处理和实验结果分析能力，培养学生的创新意识。1.2 实验原理含巯基的物质和醛类可以发生亲核加成反应形成半缩硫醛，如图1a所示。伯胺类化合物可以和醛脱水反应形成亚胺(图1b)。将此二者有机结合起来，即含有两个醛基的邻苯二甲醛可以和既含有巯基又含有氨基的物质发生反应形成巯基取代的噻唑类化合物(图1c) 1.3 仪器与试剂1.3.1 仪器EL104电子分析天平(瑞徽电子，中国)，FE20实验室用pH计(米科，中国)，UH5300紫外-可见分光光度计(Hitachi，日本)，F-4600荧光分光光度计(Hitachi，日本)，365 nm紫光灯，ICP-MS电耦合等离子体质谱仪(PerkinElmer，美国)，500 MHz核磁共振波谱仪(Bruker，瑞士)。1.3.2 试剂分析纯邻苯二甲醛( 99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，还原型谷胱甘肽(≥ 98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，二水合磷酸二氢钠(≥ 99.0%，国药集团化学试剂有限公司)，十二水合磷酸氢二钠(≥ 99.0%，国药集团化学试剂有限公司)，光谱纯二甲基亚砜(≥ 99.0%，生工生物工程股份有限公司)，去离子水(实验室自制)。1.4 实验内容1.4.1 溶液配制准确称量0.0134 g邻苯二甲醛，加入10 mL DMSO溶解，配制成浓度为1 1.4.2 光谱测试准确移取25 μL上述邻苯二甲醛溶液，向其中加入2.0 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，再加入一定体积的谷胱甘肽溶液，用PBS缓冲液稀释至5.0 mL。此时溶液中邻苯二甲醛的浓度为5 1.4.3 GSH检测限的测定向含有5 1.4.4 OPA与GSH结合比的测定OPA与GSH之间以两重动态可逆共价键结合，因此，可采用等摩尔连续变化(Job’s plot)法测定二者结合比1.4.5 GSH检测机理的验证(1) 核磁共振氢谱((2) 高分辨质谱(HR-MS)。测试OPA与GSH反应液的高分辨质谱，分析质谱数据，验证反应机理。核磁共振氢谱和高分辨质谱测试样品由学生准备，相关教师负责测试。2 结果与讨论2.1 紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测试如图3a所示，OPA在PBS缓冲液中的最大吸收峰在260 nm附近，300 nm处的吸收峰为2.2 检测限测定结果如图4(a)所示，向含有5 对应的荧光光谱如图5所示，随着GSH浓度的增大溶液在420 nm处的荧光发射峰不断增强，420 nm荧光强度与GSH和OPA浓度比也呈良好的线性(2.3 OPA与GSH结合比采用等摩尔连续变化(Job’s Plot)法探讨OPA与GSH结合比，通过测试配制的11组溶液紫外-可见吸收光谱，以340 nm吸光度对2.4 GSH检测机理的验证2.4.1 核磁共振氢谱分别测试OPA以及OPA与GSH反应生成物的核磁共振氢谱，通过对比证实二者的反应机理。邻苯二甲醛在水溶液中存在时会有单水合物和