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实验十微生物稀释平板计数、划线分离 实验十微生物稀释平板计数、划线分离 PAGE PAGE / NUMPAGESPAGE3 实验十微生物稀释平板计数、划线分离 PAGE 实验十 微生物稀释平板计数、划线分别 一、目的要求 学平板菌落数的基根源理和方法。 熟掌握倒平板技、系列稀原理及操作方法，平板涂布及划分别方法。二、基根源理 平板菌落数法是依照微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个胞生殖 而成的象行的，也就是一个菌落即代表一个胞。 数，先将待品作一系列 稀，再取必然量的稀菌液接种到培养皿中， 使其平均分布于平皿中的培养基内， 培养 后，由个胞生生殖形成菌落，菌落数目，即可算出品中的含菌数。 种数法的点是能出品中的活菌数。 此法常用于某些成品定 （如虫菌）， 生物制品定以及食品、水源的染程度的定等。但平板菌落数法的手繁， 而且 定常受各种因素的影响。 三、器材 大杆菌液，牛肉膏蛋白培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有 4． 5ml无菌 水的管，管架和号笔等。 四、操作步 （一）稀平板数 1．号： 取无菌平皿9套，分用号笔明 10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml 无菌水的管，排列于管架上，依次明 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀 用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大杆菌液放入10-1的管中，注意吸管尖端不要碰到液面，省得吹出，管内液体外溢。尔后仍用此吸管将管内液来回吸吹三次，吸 伸入管底，吹走开水面，使其混杂平均。另取一支吸管自 10-1管吸0．5ml放入10-2 管中，吸吹三次，??其余依次推。 3．取样 用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。 4．倒平板 于上述盛有不相同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至 45℃左右的肉膏蛋白胨琼 脂培养基约 10—15ml，置水平川址，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于 37℃温室中培养。 5．计数 培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按以下公式进行计算： 每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数× 5 一般选择每个平板上长有 30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。 同一稀 释度的三个重复的菌数不能够相差很悬殊。由 10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌 液中总活菌数也不能够相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的， 一般以三个稀释度中的第二稀释 度倒平板所出现的平均菌落数在 50个左右为最好。 平板菌落计数法的操作除上述的以外， 还可用涂布平板的方法进行。 二者操作基真相同， 所不相同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板， 待凝固后编号，并于 37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，尔后用无菌吸管吸取 0．2ml菌液对号接种于不 同稀释度编号的培养皿中的培养基上， 再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布平均， 平放于 实验台上20—30分钟，使菌液浸透入培养基内，尔后再倒置于 37℃的温室中培养。 （二）划线法分别 1、倒平板  图Ⅴ-3 平板划线操作表示图 将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基 分别倒平板，并注明培养基的名称。 2、划线  在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释  10倍的土壤悬液  -环在平 板上划线(图Ⅴ-3)。划线的方法很多，但无论哪一种方法划线，其目的都是经过划线将样品在平板进步行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有以下二种： 图Ⅴ-4 划线分别表示图 ⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上节余物烧掉，待冷却后经过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法经过第二次平行划线部分作第三次平行划线和经过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图Ⅴ-4，A)。划线达成后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 ⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线达成后，盖上皿盖，倒置温室培养。 五、实验报告 1．结果 将计数结果填入下表。 2．思虑题 (1)为什么溶化后的培养基要冷却至 45℃左右才能倒平板 (2)要使平板菌落计数正确，需要掌握哪几个要点为什么 (3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果可否相同为什么 (4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。