实验一蛋白质的沉淀与凝固.docVIP

□实验内容 实验一 蛋白质得沉淀与凝固 蛋白质溶液就是一稳定得亲水性溶胶液 , 其稳定得因素有二 :一就是蛋白质胶粒 上得电荷使之相互排斥 , 不易凝集成团 ; 二就是胶粒表面得水化膜 , 它使胶粒与水融洽相 依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液得因素被破坏 , 蛋白质 将于溶液中沉淀析出。 促使蛋白质沉淀得因素很多，大致可分为两类 : 第一类就是可逆得沉淀反应。 这时蛋白质得空间构象未受到很大改变 , 除去沉淀因素后 , 可以重新溶解，例如盐析与低温乙醇沉淀蛋白。 第二类就是不可逆得沉淀反应 , 重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构 发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆得蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性 得蛋白质在等电点附近加热时 , 蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实得凝块。 一、 蛋白质得盐析 [ 原理 ] 高浓度得盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又就是强电解质 , 可抑制蛋白 质得解离 .因而用高浓度得中性盐 , 使蛋白质带电量减少， 水化膜破坏而从溶液中沉淀出 来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。 由于蛋白质得组成及性质不同 ,所以盐析时所需中性盐得浓度也不相同 . 例如半饱与得 硫酸铵沉出球蛋白 , 饱与得硫酸铵则沉出清蛋白。 [操作] 、取一试管，加入 3ml 5%蛋白质溶液及 3ml 饱与硫酸铵溶液 , 摇匀静止数分钟后 观察现象。 2、 将试管内容物过滤 , 加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱与状态，摇匀后观察现 象。（ 注意固体硫酸铵若加到过饱与则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。 ） 3、 取上项浑浊液1ml,加水2m I,观察就是否复容. 二、 乙醇沉淀蛋白质 [ 原理 ] 乙醇就是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜 ;此外,加入乙醇可使水得介电常数变小， 蛋白质解离度降低 , 带电量减少 . 故加入乙醇能破坏蛋白质得胶体性质而使蛋白质沉淀。 用此法在低温下操作可使沉出得蛋白质保持其理化特性及其生物学活性， 但室温中乙醇 与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆得沉淀。 ［操作］ 1.取试管4支,标出1、2、3、4号码,按下表操作 试剂 1 2 3 4 5%蛋白质溶液（ml） 1 1 1 - 1%乙酸（滴） 一 1 -2 - - 95% 乙醇（ml） —— —— —— 2 2、将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管得冰乙醇倒入第3管中（此 步最好在冰水中进行）,混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴得乙醇2 ml混匀,观察 各管得沉淀情况并立即向第1、 2及3管中各加入蒸馏水10 ml,混匀，比较各管变化 并解释之. 三、 重金属盐沉淀蛋白 ［原理］ 在溶液得PH值大于蛋白质得等电点时，带负电荷得蛋白质与重金属离子（Ca 2+、Hg 2 +、Ag1+、Pb2 +等）结合成盐而沉淀。 ［操作］ 取试管4支,按下表操作。 试剂（滴） 1 2 3 4 5 %蛋白质溶液 5 5 5 5 1%乙酸 一 一 10 10 10g/L硫酸铜 3 —— 3 一 30g /L硝酸银 一 3 —— 3 混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之 四、生物碱试剂沉淀蛋白 ［原理］ 能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应得物质称为生物碱试剂 ，如鞣酸、 苦味酸、磷钨酸等. 在溶液得PH值小于蛋白质得等电点时，带正电荷得蛋白质与生物碱试剂得负离子 结合成盐而沉淀。 ［操作］ 取试管3支，按下表操作。 试剂 1 2 3 5%g白质溶液（ml） 1 1 1 1%乙酸（滴） 10 10 10 苦味酸溶液（滴） 数滴 - - 鞣酸溶液（滴） - 数滴 - 三氯乙酸溶液（滴） —— —— 数滴 混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之 五、蛋白质得加热凝固 ［原理］ 蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固 ，在加热过程中，随着蛋白质变性 作用得深化，使已变性得蛋白质分子间凝聚成凝胶状得蛋白块。但应注意，当蛋白质溶 液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷得排斥作用并 不发生凝固现象。 ［操作］ 取试管4支，按下表操作 试剂 1 2 3 4 5 %蛋白质溶液（ml） 2 2 2 2 1%乙酸（滴） —— 1-2 —— 一 10%乙 酸(ml) - —— 0、5 - 100g/ L NaOH( ml) —— —— - 0、5 混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出得多少、快慢并解释之。 。另 外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察就是否复溶，为什麽？ ［试剂］ 1。5%g白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤 ?饱与硫酸铵溶液. .硫酸铵结晶粉末。 4 . 9 5%乙醇。 5 . 1%乙酸与10%乙酸。 6。30g/ L硝酸银溶液。