随机引物与oligodT区别.pdfVIP

使用 oligo dT 引物扩增的产物 , 可以保证扩增产物包括 mRNA 的 3末端 (减少 rRNA 的干扰 ), 但是 oligo dT primer 扩增有一个问题 , 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的 问题 , 之所以有长度这个问题 ,一方面和 lz 所提到的 RNA 完整性有关 ,但最重要的限制在于逆 转录酶的延伸能力 . 用 oligo dT primer 扩增可能出现扩增出来的片段长度短 , 虽然都有 mRNA 的 3 端 , 但是序列信息多位于 3-UTR 附近 , 若扩增序列太短 ,则有用信息很少 , 不利 于序列的识别和分析 . 使用 random primer , 也有片段长度的限制 , 但是由于它的逆转录并不一定在 mRNA 的末端 起始 , 而是在随机位置起始 ,所以它的扩增片段带有更多 CDS 的信息 .但是如果是用总 RNA 逆转录的话 ,有可能会受到 rRNA 的干扰 . 至于 Gsp, 只是在扩增已知 gene/gene family 以及部分原理的 RACE 中使用 . 用随机引物时 要去除总 RNA 中的 tRNA rRNA, 只保留 mRNA 如果接下来你的 PCR 产物是外显子，就用 oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子，就用 random mRNA 反转录之后的 cDNA 为模板进行 PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉 了。所以不知道 “内含子 ... 这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！” 如果你想要做蛋白表达，就用 Oligo dT ，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。 我最近在用逆转 cDNA 为模板扩增 CDS 序列 （3000bp 左右），同时用 oligodT 和 random 引 物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有 random 能扩出目的带， 尤其是中间段和靠近 5,端的 CDS 区——这结果基本和网上很多资料相吻合 —— 比如随机引 物更适合 CDS 长的、有二级结构的基因。 显然是选 random primer 更好，其实说明书是有写的啦，原因是 RT-PCR 逆转录 是要得到一 个所有的 RNA 的 cDNA 库，然后再 P 出你要的 “几个基因 ”，所以不是每个基因的 mRNA 都是有 polyA 的，很多都是没有的， microRNA ，piRNA ，很多都没有哦， 所以如果你用 oligo dT 引物 ，就自然会 miss 掉很多（确实是很多）的 RNA ，而 随机引物 不会有这个问题，用 它反转录 出来的 cDNA 丰度 更高，结果更加准确 看你的目的基因的 mRNA 有没有 polyA 尾巴 有的话就用 oligodT 没有的话就用 随机引物 一般在反转录的时候除了引用特异性引物和 oligodT 作为反转录得到第一条 cDNA 链外，运 用随机引物的效果也很好，随机引物一般有 6-10 碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机 的，也就是说随机引物是各种引物的混合物， 随机序列的肯能性很多， 由于随机引物可能在 一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 CDNA ；现在随机引物已经商品化， 没有必要自己合成，直接购买就可以， Takara 公司就 有，我用的挺好的，有两种： pd(N)6 -含有 6 个碱基的随机序列； pd