常量肉汤稀释法讲课教案.docxVIP

学习资料 常量肉汤稀释法 1.1.1. 抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于 1000 μg/ml( 如 1280 μg/ml) 或 10 倍于最高测定浓度。 溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 抗菌 药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。 例如：需配制 100 ml 浓度为 1280 μg/ml 的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂， 其药物的有效力为 750 μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为 182.6 mg。 根 据 公 式 计 算 所 需 稀 释 剂 用 量 为： （ 182.6 mg× 750 μg/ml ） /1280 μ g/ml=107.0ml ，然后将 182.6 mg 抗生素粉剂溶解于 107.0ml 稀释剂中。制备抗 菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表 5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于 -60 ℃以下环境，保存期不超过 6 个月。 1.1.2. 药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据 NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标 准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用 Mueller-Hinton （MH） 肉汤， pH7.2~7.4 。需氧 菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性 时，应在肉汤中加入 2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的 MH肉 汤。嗜血杆菌属菌使用 HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含 2%~5解马 血的 MH肉汤。 1.1.4. 接种物的制备 有 2 种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑 取形态相似待检菌落 3-5 个，接种于 4-5ml 的水解酪蛋白（ MH） 肉汤中， 35℃孵 育 2-6h。 增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或 MH肉汤校正浓度至 0.5 麦氏比 浊标准，约含 1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如 流感嗜血杆菌、 淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株， 推荐直 接取培养 18~24h 的菌落调配成 0.5 麦氏比浊标准的菌悬液。 用 MH肉汤将上述菌 悬液进行 1 ∶100 稀释后备用。 注意应在 15 分钟内接种完配制好的接种物， 并取 一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（ 13×100mm）13 支，排成 一排，除第 1 管加入 1.6mlMH肉汤外，其余每管加入 MH肉汤 1ml，在第 1 管加 入抗菌药物原液（如 1280 μg/ml ） 0.4ml 混匀，然后吸取 1ml 至第 2 管，混匀 后再吸取 1ml 至第 3 管，如此连续倍比稀释至第 11 管，并从第 11 管中吸取 1ml 仅供学习与参考 仅供学习与参考 学习资料 弃去， 第 12 管为不含药物的生长对照。 此时各管药物浓度依次为 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25 μg/ml 。然后在每管内加入上述制备好的接种 物各 1ml，使每管最终菌液浓度约为 5×105CFU/ml。第 1 管至第 11 管药物浓度 分别为 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 05、 0.25、 0.125 μg/ml。 1.1.6. 孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置 35℃普通空气孵箱中孵育 16~20h； 嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育 20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球 菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满 24h。 1.1.7. 结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的 MIC 前，应检查生长对照管 的细菌生长情况是否良好， 同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污 染， 质控菌株的 MIC值是否处于质控范围。 以肉眼观察， 药物最低浓度管无细菌 生长者，即为受试菌的 MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断， 与阳性生长对照管比较抑制 80%细菌生长管药物浓度为受试菌 MIC。 根据 NCCLS推荐的分界点值标准， 判断耐药（resistant